可视化核酸试纸条法快速检测肉及肉制品中鸭源成分

赵良娟，张霞，刘国红，郑文杰

（天津出入境检验检疫局，天津300461）

民以食为天，食以安为先。肉及肉制品的质量安全问题是全世界共同关注的热点问题。近年来，我国有一些不法企业使用相对廉价的猪肉、鸭肉等肉类原料，通过各种手段的深加工，冒充牛、羊肉制品进行销售以谋取不当利益，严重侵犯了消费者的合法权益。2013年初，欧洲的“马肉风波”[1]，使得消费者“闻马色变”，欧美的“鱼肉风波”又再一次拉响了肉及肉制品质量安全的警钟。检测鉴别肉及肉制品中动物源性成分的研究成为国内外研究的热点领域。

国内外的学者应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）及实时荧光PCR技术对食品中牛、羊、马、骆驼、猪、鸡、鸭、火鸡等动物源成分进行了有效鉴别[2-17]，我国于2016年发布了食品中鸭成分检测的PCR方法[18]。

PCR技术是一种有效的DNA扩增技术，但是PCR产物电泳检测耗时、易污染、程序复杂、EB染色时对环境有危害。实时荧光定量PCR技术具有高效、快速的优点，但是需要大型仪器设备和进口试剂，价格昂贵，且对操作人员有较高的技术要求。

因此，开发低成本、易操作、具有较高的灵敏度、准确度且环保的现场快速检测方法用于样品初筛是食品掺假丞待解决的问题，而且可以满足食品安全现场监管和迅速响应的需要，具有重要意义。

20世纪80年代末发展起来的胶体金免疫层析法（gold immune chromagraphy assay）是一种快速的免疫学测定方法[19]，是胶体金标记技术和免疫层析技术相结合的产物，基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体发生反应，在检测线位置，阳性反应在试纸条上出现红色条带，阴性反应不显色。

PCR结合可视化核酸试纸条方法通过核酸引物两端修饰相应标记物（如生物素、荧光素），同时试纸条上相应位置标记对应抗体，就可以实现PCR扩增产物的试纸条检测。目前该技术已应用于食品中致病菌的检测[20-21]，具有快速、高效、成本低等优势。

本研究根据鸭线粒体基因组特异性基因片段设计引物，建立鸭成分快速检测的PCR-免疫胶体金试纸条方法，为检测和鉴别肉及肉制品中鸭成分提供一种快速、简便的分子生物学初筛方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品

试验所用鸡、鸭、鹌鹑、猫、狗、鼠、猪、马、牛、水牛、羊、驴、鹿、骆驼、兔、貂、狐狸、胡萝卜、白菜均为天津出入境检验检疫局提供。所有样品经基因组测序和比对确认为相应物种。

1.1.2 试剂

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）、Loading buffer，DNA marker：天根生化科技有限公司；dNTP Mixture、10X PCRbuffer（Mg2+Plus）：普洛麦格生物技术有限公司；Taq DNA polymerase：TaKaRa生物技术有限公司；琼脂糖：sigma公司；核酸通用试纸条及展开液：北京华大蛋白研发中心有限公司。

1.1.3 设备

离心机（5417R）：Eppendorf公司；电泳仪（P25）：Biometra公司；PCR扩增仪（T00）、凝胶成像仪（XR+）：Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

用天根生化科技有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），按照试剂盒要求提取。

1.2.2 引物设计及标记分子

根据NCBI中已经发表的鸭线粒体基因组序列为依据，以鸭线粒体CytB区域为靶标，应用Geneious 6.1序列分析软件进行引物设计，设计了一对鸭线粒体DNACytB区的引物，上下游引物分别用异硫氰酸荧光素（FITC）和生物素（biotin）标记，上游引物为 F1，下游引物为R1，目的片段291 bp，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2.3 PCR反应体系及反应条件

PCR反应体系为：模板DNA 1.0 μL，PrimerF1/R1 0.8 μL，dNTP mixture 2.0 μL，10X PCRbuffer（Mg2+Plus）2.0 μL，Ex Taq Hot Start（TaKaRaTaqTM）0.2 μL，ddH2O 13.2μL，总体积20μL。反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环后进入72℃ 5 min。

1.2.4 试纸条检测

取5 μL PCR产物点于核酸试纸条样品垫，再滴加95 μL展开液进行检测，5分钟后观察结果。试纸条质控带出现红色为有效结果，检测带出现红色为可疑阳性，检测带未出现红色为阴性，可疑阳性样品需进行测序或SN标准方法验证。

1.2.5 电泳检测

PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，电压100 V，电流110 mA，时间40 min，检测有无目的条带。

1.2.6 方法特异性

以鸭肉基因组DNA为阳性对照品，选择鸡，鹌鹑，猫，狗，鼠，猪，马，牛，水牛，羊，驴，鹿，骆驼，兔，貂、狐狸及植物样品胡萝卜、白菜等的基因组DNA为阴性对照，以无菌水为空白对照，用建立的PCR-试纸条方法进行检测，并同时进行电泳检测。

1.2.7 方法的实际灵敏度

以鸭肉为阳性样品，牛肉模拟掺假样品，制备鸭肉/牛肉的混合模拟样品，以鸭肉肉粉的质量百分比为100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%比例混匀，提取基因组DNA，用建立的PCR-试纸条方法进行检测，并同时进行电泳检测。

1.2.8 市售肉及肉制品的检测

应用所建立的可视化试纸条方法对市售不同品牌的烤鸭、鸭脖、鸭爪、鸭翅制品、羊肉片、羊肉卷等30份肉及肉制品进行测试，检测结果与现行行业标准对比。

2 结果与分析

2.1 引物的特异性

以1.2.3 PCR-试纸条反应体系及程序进行引物特异性检测，电泳及试纸条结果如图1所示。

图1 鸭源性成分引物特异性检测结果Fig.1 Results of species specificity of PCR with duck primers

鸭肉样品PCR扩增产物电泳检测为291 bp扩增片段，试纸条检测质控带红色，检测带红色，结果为可疑阳性。试纸条检测可疑阳性的扩增产物经过测序、比对，结果显示与鸭序列具有99%同源性。

其他动植物样品均只有质控带红色，检测带无条带，试纸条检测结果与电泳结果一致，表明该方法特异性好，能对鸭成分进行有效扩增与检测。

2.2 方法灵敏度

以上述PCR-试纸条反应体系及程序进行灵敏度检测，电泳及试纸条结果如图2所示。

图2 鸭源性成分实际灵敏度检测结果Fig.2 Results of sensitivity of duck specifes

PCR-试纸条检测结果表明，当鸭肉在混合肉品中的比例为100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%时，试纸条质控线和检测线均能显示红色条带；最低检测限可达0.1%。

2.3 市售肉及肉制品的检测

应用所建立的可视化试纸条方法对市售不同品牌的烤鸭、鸭脖、鸭爪、鸭翅制品和羊肉片、羊肉卷等肉及肉制品进行实际样品测试，结果见表1

表1 市售样品检测结果Table 1 Result of sample in the market

由表1可知，检测结果与现行行业标准检测结果一致，说明所建立的PCR-可视化核酸试纸条方法能够快速检测肉及肉制品的鸭源性成分。

3 结论

本文以鸭线粒体基因组序列为依据，设计其ATP8-ATP6基因区间的物种特异性引物，并在两端标记异硫氰酸盐（Fluorescein 5-isothiocyanate，FITC）和生物素（Biotin），用含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对PCR产物进行筛选检测，从而建立了食品中鸭成分快速检测的PCR-可视化核酸试纸条方法。

对鸭样品的扩增结果说明，只有鸭成分的样品扩增出291 bp特异性目的条带，试纸条检测线变红，而其它常见动植物样品鸡、鹌鹑、猫、狗、鼠、猪、马、牛、水牛、羊、驴、鹿、骆驼、兔、貂、狐狸、胡萝卜、白菜等均无非特异性扩增条带，试纸条检测线未变红色，试纸条检测结果与电泳结果一致，这表明所设计的鸭特异性引物具有较好的物种特异性。从灵敏度试验结果来看，该试验PCR-试纸条检测灵敏度可以达到0.1%，比电泳高10倍，表明方法具有较强的灵敏度。

应用所建立的可视化核酸试纸条方法对市售不同品牌的烤鸭、鸭脖、鸭爪、鸭翅制品和羊肉片、羊肉卷等30份肉及肉制品进行实际样品测试，烤鸭、鸭脖、鸭爪和鸭翅均检测出鸭源成分，10份羊肉片中2份检出鸭源成分，10份羊肉卷中3份检出鸭源成分，检测结果与现行行业标准检测结果一致。说明所建立的PCR-可视化核酸试纸条方法能够快速检测肉及肉制品的鸭源性成分，而且市售羊肉片、羊肉卷存在不同程度的掺假，与标签成分不符合现象。

可视化核酸试纸条法充分利用PCR检测的高灵敏度、特异性强的特点，又结合了免疫金标试纸条简便、快捷、成本低的优势，为检测和鉴别食品中鸭成分提供一种快速、简便、低成本的分子生物学初筛方法，能够实现食品中鸭成分的现场快速检测，进而为食品安全监管提供技术支持与保障。

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