糖肾康胶囊中淫羊藿提取纯化工艺研究

黄 涛

(天津市儿童医院，天津 300134)

糖肾康胶囊处方来源于临床经验方，由淫羊藿、黄连、黄芪、知母、益母草和丹参等7味药材组成，用于治疗糖尿病肾病，疗效显著。有文献报道[1，2]，黄连中的季铵型生物碱由于碱性较强，容易与黄酮类、醌类、苷类、鞣质等成分发生化学反应而生成沉淀，同时考虑到有效成分黄连生物碱的溶解性，将黄连用乙醇单独提取，其余水溶性成分仍沿用临床验方的提取方法，采用水回流进行提取的工艺路线。由于黄连的提取工艺文献报道较多，所以本文就不再讨论，本文主要研究其余6味药材的提取纯化工艺。为建立科学合理的提取纯化工艺，本研究以淫羊藿苷的提取率和出膏率为考查指标，采用正交试验设计考查各因素的影响，优选出最佳提取工艺条件；以淫羊藿苷转移率和除杂率为指标，采用正交试验设计考查各因素的影响，优选出最佳纯化工艺条件，以期为糖肾康胶囊的开发提供实验依据。

1 仪器与材料

DONEX高效液相色谱仪(美国戴安)；AB204-N电子天平(万分之一，Mettler-Toledo)；BP211D电子天平(十万分之一，Sarlorius)；AS3120超声波提取器(奥特塞恩思仪器有限公司)；Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱(迪马科技)；甲醇、乙腈为色谱纯(均为天津市康科德科技有限公司提供)，水为超纯水，其余试剂为分析纯；淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号10737-200312，纯度：>98%，供含量测定用)；淫羊藿、黄芪、知母等药材(安国长安中药材有限公司，批号分别为1408001、1410001、1410003、1408009、1410006、1409001)，经检测符合《中国药典》2015年版一部要求。

2 方法与结果

2.1含量测定

2.1.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.05 mol/L KH2PO4盐缓冲溶液(25∶75)，流速为1.0 ml/min，检测波长为270 nm，柱温：35 ℃，进样量：对照品5 μl，供试品10 μl[3]。

2.1.2溶液制备

2.1.2.1对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品适量，至25 ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，精密量取2 ml至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配成每1 ml含淫羊藿苷18.13 μg的溶液。

2.1.2.2供试品溶液的制备 精密吸取水提取液1 ml置入5 ml量瓶，用超纯水定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.2.3阴性对照溶液的制备 取除淫羊藿、黄连之外的其他5味药材，按提取工艺提取，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.1.3系统适用性试验 取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，理论塔板数以淫羊藿苷峰计算不低于3 000。淫羊藿苷与相邻色谱峰的分离度大于1.5，对称因子在0.95～1.05之间。供试品中其他成分对淫羊藿苷的测定无干扰。结果见图1。

2.1.4线性关系考查 精密吸取对照品溶液4、8、12、16和20 μl，按“2.1.1”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，以峰面积对进样量(μg)进行线性回归，得回归方程Y=2 646X-1.51(r=0.999 9)，结果表明淫羊藿苷在0.073～0.363 μg范围内，与峰面积具有良好的线性关系。

1.淫羊藿苷

2.1.5含量测定 精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件测定淫羊藿苷峰面积，计算含量。

2.1.6出膏率测定 精密量取提取液5 ml，置于已于105 ℃干燥至恒重的蒸发皿中，置水浴上蒸干，于105 ℃干燥至恒重，计算出膏率。

2.2正交试验考查淫羊藿等6味中药提取条件[4-6]

2.2.1正交试验 依据预试验结果，取淫羊藿等6味中药饮片共160 g，按照正交试验表L9(34)安排试验，见表1。按“2.1.2.2”项下供试品溶液的制备处理，测定提取液中淫羊藿苷的含量，计算提取率，并测定出膏率。用正交设计助手Ⅱ V3.1专业版软件进行统计分析，结果见表2和表3。对表2中试验结果进行数据处理，并进行直观分析和方差分析。以提取率为评价指标，表2中极差R值大小显示，各因素作用主次为C>A>B，方差分析结果表明：C的影响具有统计学意义(P<0.05)，以A3B1C3组合为佳；以出膏率为评价指标时，表2中极差R值大小显示，各因素作用主次为C>B>A，方差分析结果表明：C的影响具有统计学意义(P<0.05)，以A3B2C3组合为佳。综合考虑生产周期及成本，确定最终提取工艺为A3B3C3，即加14、12、12倍量水，提取3次，1 h/次。

2.2.2工艺验证试验 取淫羊藿等6味中药饮片共160 g，加入14、12、12倍量水，提取3次，1 h/次。验证试验平行操作3次，进行含量测定，计算提取率和出膏率，结果见表4。可见所确定的工艺合理可行，稳定可靠，具有可重现性。

表1 提取正交试验因素水平表

表2 提取正交试验结果

表3 提取正交试验方差分析表

注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

表4 提取工艺验证结果

2.3醇沉工艺[7]

2.3.1正交试验 取淫羊藿等6味中药的水提取液，分别浓缩至相对密度为1.10、1.15和1.20，按照正交试验表L9(34)安排试验，见表5。精密吸取水提醇沉液1 ml置入5 ml量瓶中，稀乙醇定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，测定醇沉液中淫羊藿苷的含量，计算醇沉转移率，见公式1。

×100%

(公式1)

分别按“2.1.6”项下方法，测定浓缩液和醇沉液的出膏率，按照公式2计算除杂率。

×100%

(公式2)

按公式3计算总转移率。

×100%

(公式3)

用正交设计助手Ⅱ V3.1专业版软件进行统计分析，结果见表6和表7。

表5 醇沉工艺正交试验表

表6 醇沉工艺正交试验结果

对表6中试验结果进行数据处理，并进行直观分析和方差分析。以转移率为评价指标，表6中极差R值大小显示，各因素作用主次为B>A>C，方差分析结果表明：A、B的影响均具有统计学意义(P<0.05)，以A1B3C2组合为佳；以除杂率为评价指标时，表6中极差R值大小显示，各因素作用主次为B>A>C，方差分析结果表明：A、B的影响均具有统计学意义(P<0.05)，以A3B3C1组合为佳。考虑到转移率评价指标的重要性，同时考虑到生产周期，确定醇沉工艺为A1B3C1，即相对密度1.10，醇沉至80%，醇沉12 h。

表7 醇沉工艺正交试验方差分析表

注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

2.3.2工艺验证试验 取淫羊藿等6味中药水提液，减压低温浓缩至浓缩液密度为1.10，加95%乙醇醇沉至80%，静置12 h，滤过，即得。验证试验平行操作3份，进行含量测定，计算醇沉转移率和除杂率，并计算总转移率和出膏率，结果见表8。可见所确定的工艺合理可行，稳定可靠，具有可重现性。

表8 醇沉工艺验证结果

3 讨论

3.1糖肾康胶囊由淫羊藿、黄连、黄芪、知母、益母草和丹参等7味药材组成，胶囊剂具有能掩盖药物的不良气味、提高药物的稳定性、生物利用度高等优点，但是胶囊剂填充量有限，若要将原方制成中药新剂型胶囊，则需经提取纯化处理，以富集有效部位，减少服用量，同时也使患者更容易接受。由于淫羊藿等6味中药的水提取工艺出膏率较高，制剂时较难成型，同时考虑到DM病人不宜服用含糖成分，而水提取物的糖类成分较多，故考虑利用醇沉工艺将其除去。

3.2淫羊藿、黄芪为君药，益母草、知母、丹参等4味中药为佐使药，仍沿用临床验方的提取方法，采用水回流进行提取。由于黄芪指标成分黄芪甲苷、益母草指标成分水苏碱、知母指标成分菝葜皂苷元的测定较为复杂，且重现性差，因此不将其列为考查指标。淫羊藿为方中君药，相比丹参中指标成分丹酚酸类成分的活血作用，淫羊藿中主要指标成分淫羊藿苷具有补肾的作用，对糖尿病肾病的治疗更重要，因此确定将淫羊藿苷提取率作为水回流提取的考查指标[8，9]。

3.3通过正交试验优选了淫羊藿等6味中药的提取纯化工艺，采用直观分析和方差分析方法确定了最佳提取纯化工艺，淫羊藿等6味中药的水提取工艺为：加水14、12、12倍量，提取3次，每次1 h；其浓缩液醇沉工艺为：浓缩液密度1.10，加乙醇醇沉至80%，静置12 h。按照优选出的最佳提取纯化工艺进行验证性试验，所得提取液的提取率均达到80%以上，稳定性较理想，适合于工业生产，故此方案合理可行。

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7 冯青然, 王元瑜, 马振山, 等. 中药水煎煮液分离、纯化工艺的比较研究[J]. 中国中药杂志, 2002, 27(1): 28-30

8 杨敏. 中药药对治疗糖尿病肾病临证撷菁[J]. 辽宁中医, 2006, 33(4):462-463

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