CAⅨ在肾细胞癌中的表达及临床意义

陶泽宇 李龙 杨小淮

肾细胞癌(RCC)是临床上最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一。肾细胞癌的发病率仅次于膀胱癌，并逐年增加[1]。30%～50%的肾细胞癌缺乏早期临床表现，20%～30%的肾细胞癌早期出现淋巴转移、骨转移以及远处转移，即便未出现早期转移的患者经手术干预后也会复发转移，所以早期诊断和及时治疗非常重要[2]。目前临床上肾细胞癌的诊断以影像学检查、穿刺活检等为主，缺乏精准无创的方法。CAⅨ作为一种新型碳酸酐酶异构体，在研究中发现与肾癌的发生发展密切相关，该结构在VHL（Von hippellindau）基因的下游，由缺氧诱导因子-1 (HIF-1)通路激活[3]。随着分子生物学的发展，CAⅨ可作为RCC诊断和治疗的新靶点。肾癌的主要病理类型为透明细胞肾细胞癌(ccRCC)，占60%～85%[4]。本研究利用免疫组化SP法检测肾透明细胞癌中CAⅨ的表达情况并结合相关文献分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取我院2015～2017年肾癌根治术后病理标本中肾透明细胞癌标本60例，其中男37例，女23例；年龄27～75岁，平均53岁；采用2010年AJCC的TNM分期和AJCC分期组合：其中Ⅰ期18例，Ⅱ期29例，Ⅲ期10例，Ⅳ期3例；以20例其他少见类型肾癌标本和30例正常肾组织标本作为对照。其中，8例肾乳头状癌，7例肾嫌色细胞癌，3例Bellini集合管癌，2例囊性肾细胞癌，正常肾组织标本均取自单纯性肾切除术后。标本均在35%甲醛溶液固定后包埋于蜡块中。实验材料包括：CAⅨ单抗、二甲苯、PBS缓冲剂、DAB显色剂、枸橼酸缓冲液等。

1.2 方法 ①烤片:于70℃烤片机中烤20min。②二甲苯脱蜡后梯度乙醇脱水:组织切片浸泡于二甲苯中20min→更换50%二甲苯浸泡5min→100%酒精5min→80%酒精5min→70%酒精5min。蒸馏水:洗脱5min，2次。③阻灭内源性过氧化物酶:3%过氧化氢37℃孵育10min，PBS清洗15min。④抗原修复:0.01 M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)，煮沸(95℃，15～20min)，冷却 25min，冷水冷却至室温后清洗，再用PBS洗涤10min。⑤染色观察:置于4℃恒温箱加入CAⅨ单克隆抗体孵育过夜，DAB染色剂染色。成功染色后，用蒸馏水冲洗，并在显微镜下观察盖玻片。

1.3 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

60例ccRCC标本中CAⅨ的阳性表达率为85.0%(51/60),正常肾组织中CAⅨ阳性表达率为0。CAⅨ在肾乳头状癌中阳性表达率为25.0%(2/8)，在嫌色细胞癌中阳性表达率为14.3%(1/7)，在Bellini集合管癌和囊性肾细胞癌中无阳性表达。CAⅨ在肾透明细胞癌中表达水平明显高于正常肾组织和其他少见类型肾癌，差异有统计学意义（χ2=99.2，P＜0.05）。

3 讨论

肾细胞癌约占成人恶性肿瘤的2%～3%，是第二常见的泌尿系统恶性肿瘤，发病率仅次于膀胱癌，呈逐年上升趋势[4]。因缺乏特征性临床表现，早期仅6%～10%患者会出现典型的血尿、腰痛、腹部肿块等，大部分为无症状肾癌，约占63%[5]，所以肾癌的早期诊断和治疗非常重要。目前，早期肾癌的诊断主要依靠影像学方法和临床医师的经验，具有偶然性和不确定性，尚无特异性肿瘤筛查方法。此外，对于晚期肾癌仍无有效的治疗方法。

CAⅨ在正常组织中表达水平极低，仅在成人输精管上皮、胆管、脉络膜血管丛、小肠和腮腺等组织中散在表达，而在胎儿成熟的肺和肌肉组织中具有较高的表达[6]。但在肾癌中CAⅨ的表达与其他组织表达机制不同，可能与缺氧诱导因子(HIF)和其它转录因子被充分羟基化有关。CAⅨ是VHL-HIF信号通路的下游基因，VHL是一种肿瘤抑制基因，VHL蛋白具有降解HIF的作用，能够维持正常细胞的有氧微环境。当VHL突变或丢失，HIF在细胞内累积，在肿瘤细胞周围形成缺氧的微环境并激活其下游靶基因CAⅨ[7]。CAⅨ是一种由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，它可以将细胞内的H+通过H+-Na+离子泵输送到细胞外[8]。两者共同造成适合肿瘤生长的酸性缺氧微环境。

肾癌尚缺乏早期诊断手段，而CAⅨ在肾癌中的特殊高表达性可作为潜在肿瘤标志物的依据，因CAⅨ主要存在于肾癌肿瘤细胞，在外周血几乎检测不到CAⅨ，所以有学者提出检测肾癌患者外周血中的CAⅨ-mRNA来间接判断原发肿瘤中CAⅨ的水平。Mckieman等[9]应用RT-PCR技术研究肾细胞癌患者的外周血CAⅨ-mRNA表达，结果发现在46%未转移以及56%已转移肾细胞癌患者的外周血中出现阳性表达，而肾良性病变患者不表达。通过统计学分析发现CAⅨ-mRNA具有97.6%的特异性和48.7%的敏感性。国内学者向萌[10]利用RT-PCR技术，检测30例肾细胞癌患者及30例肾良性病变患者外周血中CAⅨ-mRNA水平，结果显示，肾细胞癌患者外周血中CAⅨ-mRNA阳性表达率为43%(13/30)，而肾良性病变患者外周血中均呈阴性，且肾透明细胞癌患者外周血中CAⅨ-mRNA的阳性表达率54.5%(12/22)明显高于其他组织类型(P＜0.05)。说明CAⅨ作为肾癌肿瘤标志物时具有高度特异性，但敏感性较差，无论有无早期转移，均能在外周血中检测到CAⅨ-mRNA，且在肾透明细胞癌中更加敏感。

对于肾癌的非手术治疗，目前主要利用CAⅨ的免疫源性在体外构建其单克隆抗体复合体，目前主流的嵌合型mAb-CAⅨ(WX-CAIX)在肾癌组织中有很高的浓聚性，可用于诊断及治疗。Siebels等[11]实验中将WX-CAⅨ与低剂量干扰素-α（LD-IFNα）联合用于治疗进展期转移性肾细胞癌（mRCC），26例根治性肾切除术后患者被纳入试验，结果显示42%（11/26）患者疗效显著。接受延长治疗的患者比16周停药患者的2年生存率更长（79% vs 30%，P=0.0083）。Bleumer等[12]进行了相同的实验，共纳入36例mRCC患者，均未出现药物相关的Ⅲ或Ⅳ级毒性反应，只有3例患者出现了可能与研究药物相关的Ⅱ级毒性反应。上述两者实验结果证实该治疗安全可靠，耐受性良好，且药物毒性小。

本实验中肾癌CAⅨ的测定主要取自术后病理，反映的主要是肿瘤局部CAⅨ的表达水平，对诊断和治疗的指导意义尚存在局限性，但对肾癌患者的预后判断具有重要价值。Bui等[13]对肾癌病理组织中CAⅨ进行染色率测定，以85%为界限，结果显示高染色率患者的总体生存中位数为24.8个月，而低染色率为5.5个月，结果表明低表达CAⅨ是预后差的标志。而本实验中60例肾透明细胞癌的CAⅨ在TNM分期Ⅰ、Ⅱ期的阳性表达率明显高于Ⅲ、Ⅳ期（97.9%vs 38.5%，P＜0.05），与上述实验结论吻合。传统分期对预后判断有局限性，加利福尼亚大学在其开发的UISS肾癌风险分级系统基础上进行改良，将CAⅨ加入评价系统，将肾癌患者分为低、中、高3个风险组，利用基因芯片技术对肾癌组织进行多分子检测，结果发现CAⅨ高表达是预后良好的标志[14]，这种定量测定技术使肾癌预后判断效率和准确性大大提高。本实验中肾透明细胞癌组中CAⅨ的阳性表达率为85.0%(51/60)，明显高于其他组，而临床上最常见的肾癌类型即肾透明细胞癌，所以该方法对大部分肾癌患者预后判断具有重要的指导意义。

综上所述，CAⅨ在肾细胞癌尤其是肾透明细胞癌中高度表达，在正常的肾组织中无表达，这种表达特异性使得CAⅨ在肾癌诊断、治疗及预后评估方面具有很高的研究价值，特别是作为肿瘤标志物和靶向治疗药物，尚需要更多的临床试验来验证CAⅨ的临床价值。