环介导等温扩增技术在甘蔗转基因及病害检测中的应用

王继华 ，蔡时可 ，曹干 *

（1.广东省农业科学院作物研究所，广东 广州510640；2.广东省农作物遗传改良重点实验室，广东 广州510640）

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等2000年发明的一种新的恒温核酸扩增方法，相较于传统的核酸扩增方法，其具有灵敏度高、特异性强、操作简单和快速高效及成本低等优点，因此被广泛应用[1]。已经报道多种转基因（Genetically modified organism，GMO）动植物和病原可以利用LAMP检测技术进行鉴定[1]。该技术也不断进行完善和改进，应用范围和精度不断提高，通过加入逆转录酶可以对RNA模板进行扩增（即RT-LAMP）[1]。近年来，转基因作物发展速度迅猛，2015年，28个国家的1800万农民种植了1.797亿公顷的转基因作物[2]。随着转基因作物种植面积的增加，对于转基因产品的检测要求也越来越严格，另一方面在转基因作物的培育中对转化植株的检测量也不断增加[3-4]，这些都需要大量的转基因检测工作，LAMP在这方面有着技术和成本上的优势，应用成功的事件也越来越多。同时该技术还可以针对某一特异转化事件的大豆、玉米进行检测，并且也已经建立标准[5-6]。近年来，LAMP也广泛应用在作物病害的检测与检疫，也建立多种甘蔗病害检测体系。在病毒病的检测方面，玉米褪绿斑驳病毒[7]和甘蔗花叶病毒[8]都已经建立了检测体系。本文就LAMP在甘蔗转基因及病害检测中的应用进行综述。

1 LAMP的基本原理与特点

1.1 LAMP的基本原理

LAMP技术的原理主要基于具有链置换活性的Bst（Bacillus stearothermophilus）DNA聚合酶和两对特殊引物，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在等温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。DNA聚合酶具有大片段的高效合成功能，具体的LAMP反应过程主要包括哑铃状模板合成、循环扩增、伸长和再循环4步。其中，LAMP哑铃状模板合成是起始，由内引物FIP的F2序列与模板DNA的F2c序列结合，形成互补的DNA链；外引物F3与模板DNA的F3c序列配对，形成互补链。再通过置换反应，FIP引导合成的互补链被释放，由于在其末端的F1c和F1可以进行配对，形成环状结构。引物BIP和B3可以结合到环的上引导合成，置换出BIP指导合成的双链。BIP指导合成出来的互补链在被置换后的两端可以自动成环（哑铃）结构。哑铃结构的DNA是LAMP反应新模板，在此基础上进行随后的循环扩增反应，最终获得分子量大小不一的扩增产物[1，9]。在此基础上通过设计一条特异的loop引物可以在LAMP反应中形成环的部位进行引导，提高合成速度50%以上[10]。

在一般情况下，LAMP可以在60 min内对目标片段扩增出109～1010倍的序列拷贝，产物的浓度高达500 μg/mL的DNA，其扩增产物既可通过常规的荧光定量或电泳检测，也可以通过简易的目测比色和焦磷酸镁浊度检测[1，11]。若在反应体系中加入逆转录酶，LAMP还可以实现对RNA模板的扩增（即RT-LAMP）[12-13]，目前也有一些方法进行了改进[14]。同时，也开展了多基因的多重扩增，在动植物病害检测上已成功应用[15-16]。

1.2 LAMP的特点

1.2.1 反应速度快，灵敏度高 LAMP依赖高活性的Bst DNA聚合酶，具有快速、高效的特点。该DNA聚合酶不需要像常规PCR反应，每一个循环中都需要变性过程，反应在55～65℃的温度范围内均可进行大量扩增，通过不断的优化和改进，整个反应的时间可以控制在30 min以内[17-18]。LAMP反应中，在DNA聚合酶的作用下，扩增产物呈几何数量级增加，在60 min内可以获得109倍的目标产物，比常规PCR技术和巢式PCR技术要高出 1～3 个数量级[1，9，19]。

1.2.2 特异性高，稳定性好 LAMP采用对目的片段的6个不同部位进行引物设计，在反应过程中需要4对引物来共同完成扩增，这就需要4对引物能够完全和目标片段进行匹配才能进行扩增，通过对严格靶序列上的这些独立区域进行严格选择就能控制反应的特异性。和常规PCR相比，其通过引物的选择就提高了反应的特异性和稳定性[20]。

1.2.3 成本低，技术要求低 完成LAMP检测所需要的设备简单。由于反应在恒温中进行，水浴锅或其它普通可控温的普通恒温设备均可以，和其它PCR相比较，不需要专门的仪器来完成反应。在结果判读方面，其扩增产物可以直接通过肉眼来进行可视化的判读，通过观察扩增管的浊度即可，不需要进行琼脂糖凝胶电泳。并且，扩增目的片段的产量与浊度成正比，完全可以通过浊度直接进行扩增量的判断[1，11]。同时，在反应中添加荧光染料（SYBR Green I[1]和HNB[21-22]）参与合成反应，结果直接通过观察颜色的变化来判断，结果更容易观察，更准确。

2 LAMP技术在甘蔗转基因及病害检测中的应用

2.1 LAMP技术在甘蔗转基因及病害检测中的应用策略

已经商业化种植的转基因作物都是经过严格的生物安全性评价，没有食品安全的风险[23]。但是，由于在法律上管理严格，GMO的检测在生产上尤为重要。目前商业化种植的作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜籽及木瓜等，外源功能基因主要有抗除草剂、抗虫、抗病等功能基因。抗虫类：主要是Bt基因；抗除草剂基因：EPSPES、BAR和PAT等，以及抗木瓜环斑病的CP基因[24]。在GMO的检测中，即可对目标基因进行特异性检测，同时也可以对转化过程中的一些转基因相关的元件进行通用的检测，GMO研制过程中的一些主要的特异元件包括：启动子、终止子以及抗性标记基因。常见的启动子元件如35S启动子[25-26]、UBI启动子和ACT启动子等；终止子如NOS终止子；标记基因如：NPT和HYG[27]。同样，针对甘蔗病原基因组的高度同源性区域也可以设计相应的检测体系，如花叶病毒的外壳蛋白基因。LAMP检测在GMO的应用上非常广泛，不仅可以通过这些已知的特异片段设计通用引物进行鉴定[28]，而且，通过对商业化种植的作物中外源基因的插入位点进行分析，确定插入位点上下游的基因，再利用目的基因和上下游基因的序列设计特异引物，可以构建该转化事件特异性的检测[29]。

2.2 LAMP技术在甘蔗转基因研究中的应用

随着分子生物学的发展，转基因技术在作物遗传改良中的应用也越来越广泛，获得的转基因植物也越来越多，目前报道的转基因植物累计超过35科120多种[2]。利用LAMP技术进行转基因作物检测的实例较多，目前已应用在转基因玉米、大豆、棉花、木瓜和油菜[26，29-39]。在转基因育种中，转化子的检测需要较大的工作量，特别是在分离群体中鉴定出纯合子，以及在杂交后代中筛选含有目标基因的植株，这些都需要大量的PCR检测来确定；LAMP的成本低，技术要求简单，快速的特点能够满足这些检测的需要。同时，在构建指纹图谱，保护知识产权方面，LAMP技术可以对拟商业化品种设计特异的检测标准。甘蔗是重要的糖料作物，遗传背景复杂，杂交育种效率低，转基因育种在甘蔗上有着较好的应用前景[40]。在甘蔗转基因育种中LAMP检测已经得到应用。周定港等利用LAMP检测转Bt基因甘蔗，检测效率达到100%，高于常规PCR的检测[41]。

2.3 LAMP在甘蔗病害检测中的应用

甘蔗生长在高温高湿地区，加之生长周期长，在生产上病害较多，包括真菌病害、细菌病害和病毒病。病原菌的检测技术在甘蔗抗病育种和病害防治中有重要作用。目前甘蔗病害的分子检测还相对薄弱，大多以常规PCR来进行鉴定。LAMP在检测技术和其它检测方式相比，有其自身的优点，已经在植物病害检疫和研究中得到应用，如玉米褪绿斑驳病毒[7]和甘蔗花叶病毒[8，42]。在甘蔗生产上，病原的准确检测可为有效防治提供技术支持，特别是在不易培养和种传的病害检测上。甘蔗花叶病和宿根矮化病在发病早期很难通过肉眼直观诊断病害，在生产上发现较晚，往往带来严重损失。目前利用LAMP检测这两种病原最为常见[42-45]，在甘蔗其它病害方面，如黑穗病[46-47]、甘蔗赤腐病[48]和甘蔗黄锈病[49]的LAMP检测技术也已经成功。LAMP检测技术在甘蔗病害检测方面的发展趋势是操作简单化，主要是结果判断的可视化。通过田间Keizerweerd利用反转录LAMP可同时检测甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒[42]。

2.4 LAMP技术检测的标准化

GMO至诞生以来，担忧其生物安全性的质疑就没有停止。严格的生物安全性管理为甘蔗转基因作物的商业化应用提供有利的保障。转基因的分子检测是重要的证据，LAMP技术已经广泛应用于转基因作物检测的各个环节，其特异检测标准在转基因大豆和玉米已经建立[16-17]，但是在转基因甘蔗上还没有固定的标准。LAMP检测的标准化主要应集中在共性检测，如针对插入元件的检测，启动子等元件。也可以针对某一商业化的甘蔗转基因品种进行，建立起指纹扩增区域，用于知识产权的保护。在甘蔗病害的检测上，建立标准化的LAMP检测体系有利于检验结果的可靠性和权威性。通过对多种甘蔗病害基因进行整合，开发多重病原的LAMP检测试剂盒，简化操作步骤，增加结果的可视性，不依赖实验室操作，在田间现场即可以使用。

3 展望

LAMP技术的建立与发展为GMO的检测提供了简便快速的方法，特别是在对GMO监管严格的要求下，该技术凭借其自身的优点在甘蔗上的应用将越来越多，为今后转基因甘蔗的商业化应用提供一定的技术支撑，具有良好的市场前景。在商业化的检测中，开发设计通用引物，提高检测的范围，最终为建立甘蔗转基因和甘蔗病害检测的统一标准体系，获得法律认证，开发相应的试剂盒打下基础，这也将是该技术在甘蔗转基因及病害检测应用中的发展方向。