工业大麻性别鉴定研究进展

崔丹丹，杨瑞芳，佘玮，李林林，苏小惠，王继龙，崔国贤

（湖南农业大学苎麻研究所，长沙410128）

大麻（Cannabis sativaL.），别称火麻、线麻，大麻科大麻属一年生草本植物。工业大麻又名汉麻，是指四氢大麻酚含量低于0.3%的大麻品种。大麻是地球上最古老的作物之一，起源于中国，栽培利用历史超过一万年［1］。在中国，大麻的利用以纺织和食用为主。作为一种天然纺织原料，大麻纤维具有吸湿、散湿、透气、消音吸波、耐热、耐晒、耐腐蚀、抗静电、防紫外线、抑菌等特点［2］，其产品受到越来越多消费者的青睐；作为一种食用油，大麻籽仁油的不饱和脂肪酸含量高达88.54%以上［3］，人体自身不能合成的亚油酸和 α－亚麻酸在大麻籽油中的比例与人体的营养需求十分接近［4］，其具有降压调脂、改善消化系统、益智健脑、助睡眠、抗衰老等功效［5］。世界长寿之乡广西巴马地区的巴马火麻油更有“长寿油”的美誉，名扬海内外。在欧洲，超过95%的大麻籽作为动物饲料（鸟食、钓饵），其余的用于以全麻籽形式生产的食物［6］。国外还使用稀酸／蒸汽联合预处理工业大麻的方法来生产乙醇［7］。

多数大麻为雌雄异株，少数雌雄同株。因雄麻纤维质量优于雌麻，生产上，若以收获纤维为目的，则期望主要种植雄麻；若以收获籽粒为目的，则期望主要栽培雌麻。但是，目前尚无准确鉴定大麻种子性别的方法，幼苗期也较难分辨，且大麻的性别表达受多种因素影响，如温度、光周期、激素、重金属盐等都能诱导大麻性别表达。不能根据收获目的使大麻雌雄株合理搭配，严重制约了工业大麻产业的发展。本文概述了大麻种子鉴别、性别表达及雌雄株早期鉴定方法，以期为工业大麻产业发展提供参考。

1 大麻种子性别无损鉴定

在生产上使用的“大麻种子”实则为其果实，卵圆形瘦果，灰白或灰褐色，果皮坚硬。《齐民要术》有载，“凡种麻，用白麻子”，“止取实者，种斑黑麻子”，即颜色偏白，两头较尖，比较轻的种子是不结实的雄麻，而色较黑，比较坚实而重的种子则是雌麻，所以，要收麻皮则用白麻子，要收种子则用黑麻子［8］；《农政全书》有载，“种子取斑黑者为上”；《图经本草》有载，“农家择其子之斑黑文者，谓之雌麻，种之则结子繁，他子则不然也”。这些古代农业书籍的经验总结均显示，颜色较黑、籽粒饱满的种子多为雌麻，颜色较浅，粒重较轻的种子多为雄麻。近年来，谷雨田［9］的研究也发现，大麻种子粒大饱满多为雌株，反之，植株多为雄株。在种子重量与性别相关性研究方面，曲超等［10］对栝楼种子研究发现，随着种子重量的增加，雄株分化比例减少，雌株比例增加。此现象可以从植物生理生化的角度解释为：为了生殖生长需要，雌麻种子需要储存更多的营养物质来抵御在生长过程中可能遇到的各种生存压力，使得雌麻种子重量高于雄麻种子。但是，这些经验性的结论缺少足够的科学试验数据和统计分析支撑，因此，其区分雌雄大麻的准确率有待进一步验证。

从重量差异角度考虑，在生产上，可使用风选式种子筛选机或重力筛选机对大麻种子进行分选，分选出的粒重饱满者雌株比例高；从颜色差异角度考虑，可考虑色选，利用种子异色粒对特定光线的吸收或反射强度不同实现异色粒的分离，达到色选目的［11］。陈涛等［12］研究了棉花种子颜色分选自动化系统，可以有效区分黑色与红棕色棉花种子。

2 大麻性别表达的影响因素

2.1 遗传因素

大麻性别由异型染色体（X和Y）决定，雄性为XY，雌性为XX。MoliterniVMC等［13］对大麻的性分化进行形态学和分子的研究发现，当第4节的叶子出现时，大麻的生殖承诺可能会发生，在第4个节点的雄性和雌性存在差异表达。由此可见，工业大麻早期鉴定需在第4节叶子长出后进行，性别诱导应在第4节叶子长出前进行。DoleželJ等［14］对雌雄异株植物的核DNA含量进行分析发现由于性别染色体异型性，雌性的DNA含量比雄性低。通过对大麻的DNA水平进行检测，得到一条长约820 bp的与雌性性别连锁的特异DNA片段［15］，若依据这些性别连锁片段，通过转基因等方式对其进行表型标记，培育出具有明显辨别表型特性的大麻品种，则有利于实现雌雄植株的早期识别。

2.2 肥料对大麻性别表达的影响

大麻用肥主要为氮、磷、钾及其他微量元素肥料，以及农家肥等。留种用大麻增施磷肥有利于提高种子产量和质量［16］。VanderWerf等［17］的研究表明，随着氮肥施用量的增加，大麻雌株比例显著增加。有人用8倍于克氏溶液的氮肥时，得到100%的雌株［18］。为了生殖生长需要，雌麻需要具有更强的生命力以抵抗各种生存压力，在氮肥使用过多时诱导产生更多雌株。但是，氮肥促进营养生长，对生殖生长有抑制作用，在生产上采用高浓度氮肥诱导雌株的方法显然不可取。磷肥具有促进开花结实，提升籽粒饱满度的作用，可在作物进入生殖生长前增施磷肥提高种子产量。

2.3 激素诱导大麻性别分化

Chailakhyan MK［19］早在1937年就提出，性激素调控植物从营养生长到开花的转变。随着对各类植物激素研究的深入，其在促进生命活动，尤其是在性别表达中的作用逐渐被阐明。检测激素和遗传之间的相互作用机制及其在植物性别分化中的作用成为解决现代许多生物学难题的重要手段。细胞分裂素的作用表现在复制和翻译水平，参与到tRNA与核糖体mRNA的复合；赤霉素表现在转录水平，通过诱导依赖细胞周期蛋白激酶基因的表达，促进细胞周期从G1期（DNA合成准备期）向S期（DNA合成期）转变。Khryanin VN［20］研究发现赤霉素与茎伸长调节中几个基因的关系，雌性植物组织中有一种特殊的细胞分裂素和一种特殊的蛋白，在雄性植物中却不存在，且激素发挥作用的阶段对植物的性别有很大影响。在许多草本植物中，花原基的发育及其性别分化与第3片叶片的发育是一致的。正因如此，在花分生组织形成后，植物激素对幼苗的处理并不能导致植株性别特征的改变［21］。这与Moliterni VMC［13］认为大麻在第4个节的雄性和雌性存在差异表达有相通之处。据Herich R等［22］的研究，大麻种子浸泡在赤霉素中24 h可以诱导更多的大麻雌株。乙烯则利能诱导大麻雄株产生雌花［23］。

2.4 重金属盐对大麻性别分化的影响

研究者使用重金属盐（Pb（NO3）2，CuSO4和ZnSO4）对大麻的植物激素状态和性别表达进行研究，发现铜盐和锌盐诱导植物雌性化，并且这种作用与玉米素积累相结合，铅盐有利于植物雄性化以及GA（赤霉素）积累。因此，植物性别表达的变化与重金属对植物激素、GA和玉米蛋白平衡的作用有关［24］。以硝酸银和硫磺酸银的阴离子络合物为原料，在遗传雌性大麻植物中诱导出了不育的雄花［25］。

3 大麻性别的早期鉴定方法

3.1 形态学水平

通过植物形态特征鉴定植株性别，简便易行，经济高效。大麻幼苗期，可根据叶片形状判断雌雄。据谷雨田［9］观察，雌株叶片短而宽，叶色深绿；雄株叶片长而尖，叶色浅绿。据此，可通过间苗期间苗来控制植株性别的比例，但水肥等其他因素会影响植株长势，故有经验的专业人员判断更为准确。

3.2 生理代谢差异鉴别

研究［26］表明，雌雄株在氧化还原能力方面存在较显著差异，雌性处于较还原状态，而雄性处于相对氧化状态，雌株幼叶较雄株有较多的过氧化物酶区带。赵云云等［27］对银杏雌雄株氨基酸组分及含量进行了研究，发现银杏雌雄株的氨基酸平均含量有差异，雄株高于雌株，其中胱氨酸和酪氨酸含量较为突出。银杏、杨梅、猕猴桃等树种叶片水溶性酚类物质总量雌株普遍高于雄株，且差异达到极显著水平［28］。该方法因无具体量化指标，且操作较为复杂，较难准确判断植株性别。目前，在大麻性别鉴定方面尚未有相关研究，可以借鉴银杏等植物的研究方法，对大麻雌雄株生理代谢进行深入研究。

3.3 化学物质分析鉴别

根据不同性别叶片对不同浓度化学试剂显色不同，彭子模［29］使用0.1%甲基红溶液对浸提幼叶的上清液进行染色，32℃水浴保温，20 h后雌株出现明显黄绿色，雄株为黄褐色。Andre C等［30］使用快蓝B盐对开花雌大麻的腺毛进行组织学观察，显微镜下，清楚地显示了包裹着乳剂的头部的薄角质层，用快蓝B盐溶液处理，很容易观察到淡红色，结果还表明，该试剂在大麻雌株茎状腺毛体中表现优越。绞股蓝苗期雌雄株鉴别则使用了0.1%BTB（溴麝香草酚蓝）溶液，染色后10 h左右颜色有明显差异，雌株的提取液为黄色，雄株为绿色。使用化学试剂染色鉴定植株性别，快速高效，且准确性较高，是雌雄异株植物性别鉴定的常用方法［31］。

3.4 DNA分子标记鉴别

特征序列扩增区域（SCAR），是从随机扩增的多态性 DNA（RAPD）技术衍生而来，通过对RAPD片段克隆、测序、序列分析后设计出一对引物，互补到原来RAPD两端的24碱基上［32］。用这对引物与原来的模板DNA进行PCR扩增，特征序列扩增区域被特异性扩增，结果稳定可靠。采用SCAR标志物对大麻进行早期鉴定，用三甲基溴化十六烷基铵（CTAB）方法从中分离出DNA，使用MADC2（来自大麻的雄性相关DNA）引物作为标记来鉴定大麻的性别。利用MADC2－F和MADC2－R引物扩增基因组DNA，制备出两个大小分别约为450 bp和300 bp的片段。在收获用于脱氧核糖核酸外牵引的组织后，将花的外观与DNA分析进行比较，分子分析结果与雄花或雌花的外观一致。说明疤痕标记可以在非常早期鉴定大麻性别［33］。

4 对于大麻性别研究的展望

4.1 工业大麻种子无损鉴定

目前，在工业大麻种子性别无损鉴定方面的研究甚少，但水稻、玉米种子无损鉴定技术较为成熟。胡伟凤等［34］使用色选机分选、色选与重力分选结合、色选与比重分选结合的方法研究了分选方式对杂交水稻种子活力的影响。在大麻种子分选及其性别鉴定中也同样具有借鉴意义。邓小琴等［35］采用融合光谱、纹理及形态特征的方法对水稻种子品种高光谱图像单粒鉴别进行研究，实现了水稻品种的单粒快速鉴别。苏谦等［36］采用近红外光谱方法实现玉米品种的快速鉴定，并对不同品种的玉米种子建立了相应的鉴别模型。故可以考虑在对大麻种子进行去杂、清选、精选后，借鉴此类检测技术实现工业大麻种子的无损鉴定，同时，加强对工业大麻种子颜色、纹理、形状、光谱特性等方面的研究。

4.2 工业大麻无性繁殖

“中国草”苎麻在栽培中多采用扦插育苗。对工业大麻进行组织培养，获得既定性别的无性繁殖后代，按需求进行雌雄株分开种植成为工业大麻发展的新方向。在人工快繁技术日新月异的今天，大麻无性快繁完全可以实现工业化生产，但是，扦插育苗的成本较种子直播高出数倍，降低扦插育苗成本是推广应用的关键。故亟需配套的大麻幼苗栽培技术及大麻幼苗种植机械设备以减少劳动力成本。优良种质、栽培技术与机械设备结合，才能更好推动工业大麻产业的发展。

4.3 工业大麻品种选育

工业大麻性别具有多样性，生产上发现，雌雄同株品种表现良好且籽粒产量高，但遗传极不稳定，适应性较差。因此，希望选育出遗传稳定、适应性优良的雌雄同株品种。但研究［37］认为，雌雄异株是大麻进化标志，雌雄同株是返祖遗传（生物体偶然出现的与祖先相似性状）。植物进化的方向是从雌雄同株进化为雌雄异株，雌雄同株大麻品种的育种是逆进化过程［38］。能否克服逆进化过程阻碍，严格隔离育种，获得能够稳定遗传、广泛适应的雌雄同株品种成为今后工业大麻相关研究的又一挑战。

4.4 工业大麻性别诱导技术

目前，对大麻性别诱导的研究主要在光周期、激素、化学试剂、重金属盐、肥料诱导等方面［39］。以上试验证明上述因素确实可以诱导大麻性别分化，但是因各种诱导方法都会受到其他因素的干扰，作用效果不稳定，目前还没有形成可以在生产上广泛使用的相关技术标准。因此，亟需深入研究各因素对大麻性别诱导的方法，形成规范完善的技术体系供生产使用。

4.5 工业大麻性别分子标记

利用大麻性别连锁片段进行分子标记，通过转基因等方式对其进行表型标记，培育出具有可以早期识别，有明显辨别表型的大麻新品种。若能将性别连锁片段在大麻子房壁细胞实现特异性标记，则有望实现通过种子颜色（纹理等）鉴定工业大麻性别。