王淑琦 黄海荣 王桂荣
结核病(TB)是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的重大传染性疾病,是当前全球关注的棘手问题。我国是全球22个TB严重流行的国家之一,也是27个耐多药结核病(MDR-TB)严重流行的国家之一。中国是同时位列于3种疾病(TB、TB并发AIDS、MDR-TB)高负担国家名单中的14个国家之一[1]。WHO期望至2035年TB的患病率减少90%,死亡率减少95%[1]。但如果没有更有效的疫苗,更短、更安全的治疗潜伏性结核感染和TB(包括耐药结核病)的方案,以及不断改良的诊断方法,将是不可能达到的。
TB的传统实验室检查为抗酸杆菌涂片染色镜检法和固体或液体培养法,但MTB培养耗时长,对菌种基本情况要求高,且活菌不易获取;抗酸染色法虽然快速经济,但敏感度低[2];而且有30%~60%的肺结核(pulmonary tuberculosis,PTB)患者无细菌学依据[3],导致涂阴PTB患者误诊误治,其死亡率接近20%[4],且10%~20%的TB传播可归因于涂阴患者[5]。另一方面,2016年估计全球有1040万例新发TB患者,其中肺外结核(extrapulmonary tuberculosis,EPTB)占15%[4],含菌量极低的特点使EPTB的诊断非常具有挑战性。因此,发现一种新技术以提高诊断效率并减少涂阴PTB和EPTB的诊断延迟具有重要意义。
Xpert检测技术是一种以聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)原理为基础的体外诊断技术,通过核酸提取、扩增和检测,将前处理后的待检标本放入密闭的反应盒中,通过上述三位一体操作程序自动检出痰标本是否菌阳、荷菌量多少,以及是否对利福平耐药[4]。WHO于2010年12月首先推荐使用Xpert技术检测PTB患者痰标本中的MTB及其耐药性,2013年开始推荐Xpert技术同时应用于小儿PTB和EPTB的诊断。随着WHO的政策发布及大力支持,这项新技术得到大量推广,使得2010—2016年间全球130个国家采用Xpert技术对超过2300万例患者进行了检测,使全球MDR-TB的检测数量增加了3~8倍[6]。这种新型的检测方法凭借其高敏感度和特异度,以及准确、快速地检测出利福平耐药基因(ropB突变基因)的特点,逐渐在临床上成为结核病检查的重要方法。
有研究显示,Xpert技术检测痰标本中MTB的检出限(limit of detection,LOD)为131 CFU/ml,2 h内即可报出结果[7]。尽管Xpert检测痰标本总的敏感度很高,但对荷菌量较少的标本检测的敏感度较低[8]。如Xpert检测涂阴痰标本的敏感度约为68%[9],检测AIDS并发TB患者的阳性检出率约为74%[10],但对HIV阳性、菌阴PTB患者的检测敏感度却降至43%[11];对TB发病率较低的高资源国家的涂阴患者检测的敏感度低至28%[12];对其他肺外标本,由于其荷菌量通常比肺部低,测定的敏感度也相应较低,尤其是胸腔积液的敏感度只有43.7%[13-14]。但也有最新报道显示涂阴患者的敏感度尚可[15],可能是因为该报道与其他低敏感度结果的研究相比,采集的样本量不够大有关。
由于Xpert技术本身独立封闭的反应环境和操作方便的大规模适用性,大大改善了对利福平耐药性和MDR-TB的诊断[16]。在与药物敏感性试验(简称“药敏试验”)和BACTEC MGIT 960液体快速培养结果做比较时,利福平的耐药率和敏感度检测的正确率甚至可达到96.71%和98.25%[9,17]。作为利福平耐药的快速检测,Xpert检测结果一般非常好,敏感度和特异度分别为94%和98%[9];然而有研究表明,Xpert检测野生型与突变型菌株混合标本的利福平耐药相关突变的能力有限[18],且检测某些导致利福平耐药的rpoB基因C533G位点突变的能力也下降[19];可能与检测患者混合感染时探针D和E产生的实时信号延迟,以及Xpert会错误识别无法导致利福平耐药的rpoB基因F514F位点沉默突变有关,而F514F位点本身为利福平耐药的无功能突变[20],导致Xpert检测偶尔产生少量样本利福平耐药的假阳性报告[21-22]。
2017年3月,WHO推荐使用新一代检测方法Xpert Ultra替代Xpert[4]。Xpert Ultra是作为新一代检测方法开发的,用于提高MTB检测和利福平耐药性诊断的敏感度。与Xpert相比,Xpert Ultra检测荷菌量少的标本(如EPTB、AIDS并发TB、儿童结核病等)敏感度更高[23],其检测特点如下:
1.检测系统的改善:与Xpert相比,Xpert Ultra的操作步骤并没有明显的改变,GeneXpert软件由原先的Dx 4.0版本及以上改变为Dx 4.6版本及以上,插件由Xpertise 6.1及以上改变为Xpertise 6.4b及以上,PCR体系由25 μl增至50 μl;Xpert检测的报阳时间与报阴时间均由原先的110 min提前至77 min和66 min;最低检出限由131 菌落形成单位(CFU)/ml下降为11.8 CFU/ml。此外,检测原理由半定量半巢式循环阈值比较变为半定量巢式PCR,并运用了高分辨率熔解曲线技术,以更好地区分ropB突变种类、将“沉默突变”报告为“敏感”,及在混合感染中检测利福平的耐药情况。根据检测的目的基因ropB由5条探针增为6条探针(即原有的4条+新增的检测两种多拷贝序列IS6110和IS1081的2条探针)。此外,Xpert Ultra在检测过程中会将菌量过低的结果判读为“MTB检出不明确”。
2.Xpert Ultra的质量控制:每个测试均以探针质控(PCC)和样品处理质控(SPC)验证探针和试剂是否符合PCR反应所需要求,以及细菌裂解情况和PCR反应是否符合检测的验收标准。IS1081或IS6110阴性而SPC阳性时,结果显示“MTB未检出”;IS1081或IS6110阳性时,则根据相应的熔解曲线判读利福平的耐药性;若样本中ropB基因扩增循环数<2,则显示“MTB检出不明确”。
3.敏感度的提高:一项评估诊断准确性的研究结果显示,Xpert Ultra的整体敏感度较Xpert技术高5%,其在涂阴和(或)培阳患者组的敏感度较Xpert技术高17%,在并发HIV感染患者组敏感度较Xpert技术高12%[23]。另一项研究表明,Xpert Ultra对HIV感染并发结核性脑膜炎的成年患者的检出率明显优于Xpert技术和培养[24]。此外,模型研究显示Xpert技术Ultra可提高PTB患者检出率,早期诊断有助于早期治疗、改善患者预后。由于Xpert Ultra敏感度的提高,极有可能也提高了对非存活MTB的检出率,导致其对高负担环境下成人PTB患者检测的特异度有所下降[25],但可喜的是,在TB低负担环境中,Xpert Ultra检测的特异度高达99.3%,为协助TB治疗提供了重要信息[23]。
Xpert Ultra和Xpert的敏感度比较检测限是通过将连续稀释量化的菌落形成单位掺入痰液样品中进行检测的。MTB标准菌株H37Rv含有16拷贝的IS6110和5拷贝的IS1081,对于该菌株,Xpert Ultra和Xpert均能在标本浓度高于200 CFU/ml时,于样本检测时间内100%正确地检测到MTB和判断利福平耐药性。在标本浓度低于200 CFU/ml时,Xpert对于TB阳性标本在浓度为100、50和25 CFU/ml时的正确检测率分别降至85%、50%和10%,检测TB的LOD为 112.6 CFU/ml (95%CI:91.9~158.2 CFU/ml),检测利福平敏感度的LOD为112.6 CFU/ml (95%CI:91.9~158.2 CFU/ml)。然而,在浓度不低于25 CFU/ml时Xpert Ultra检测的正确率均为100%,检测TB的LOD为15.6 CFU/ml (95%CI:12.2~23.1 CFU/ml),约为Xpert检测TB样本LOD经8倍稀释后的含菌量,检测利福平敏感度的LOD为105.4 CFU/ml (95%CI:78.5~178.8 CFU/ml);研究还发现,Xpert Ultra在标本浓度低于LOD浓度时仍可保证较高的敏感度,如标本浓度为2.5 CFU/ml时阳性检出率仍可达到48%[22]。
4. 改善检测沉默突变菌株:Xpert Ultra检测修复了Xpert检测ropB基因突变类型中沉默突变时错误报阳的情况,重新设计了一组ropB基因的稀松分子信标(sloppy molecular beacon,SMB),提高了决定利福平耐药相关第553号密码子突变的检测质量,尤其是突变型与野生型DNA混合时。此外,Xpert Ultra还修复了另一个ropB基因的SMB,以便将沉默突变Q513Q和F514F与其他利福平耐药相关的决定区域(rifampin resistance-determining region,RRDR)的突变区分[26]。Xpert Ultra添加额外的突变检测rpoBSMB探针(rpo4),使rpoBSMB组中的探针从3个增加到4个,rpo4 SMB也被设计成与rpoBS531L突变体比野生型序列更为互补的探针;与野生型样本检测时测得的熔解温度(Tm)相比,在存在该突变的情况下Tm值升高。
此外,Xpert Ultra将Xpert原有的rpo1探针重新设计了探针序列,旨在将沉默突变与利福平耐药相关突变区分开。当新的rop1 SMB与Q513Q或F514F突变序列杂交时测得的Tm较野生型序列杂交的Tm升高,而与RRDR突变序列杂交时则产生比野生型更低的Tm值。当研究者分别使用Xpert Ultra检测TB的双重和(或)三重突变、发生缺失,或含有终止密码子的序列发生Q513Q或F514F沉默突变的菌株时,均可监测到1个或多个rpoBSMB探针与序列杂交熔解时形成的Tm峰变化,该检测重复性良好[26]。检测系统将每个检测到利福平耐药突变序列的样本报告为“ropB基因突变”,将Tm值低于系统本身识别标准的三重突变报告为“ropB基因突变不明确”,而含有Q513Q和F514F沉默突变序列的样本则被报告为“利福平敏感”[22],规避了Xpert检测Q513Q和F514F沉默突变菌株时的假阳性报告。
综上,Xpert Ultra总体探针检测ropB基因是否突变的大致原理为:rpoB基因的特异性探针(rpo1,rpo2,rpo3和rpo4)首先同ropB杂交,然后随着Tm的升高各自的扩增子靶标熔解,形成了一条随着温度不断升高、荧光信号由弱变强再变弱的DNA熔解曲线。以检测野生型菌株测得的峰形为标准,将形成的1个或多个不同于野生型熔解曲线峰形的样本报告为“含rpoB突变和利福平耐药菌”。
5.Xpert Ultra检测的异质耐药性与兼容性:检测同时含有rpoBS531L突变的DNA和野生型DNA的混合物来评估Xpert Ultra检测异质性的能力(rpoBS531L突变为最常见的RRDR突变)[27]。S531L突变存在时,Xpert Ultra的rop4 SMB探针杂交形成熔解曲线的峰值相对野生型更高:且即使在野生型菌样本中含有仅10%突变菌DNA时仍可检出明显的突变峰,在含有5%突变菌DNA比率时亦可检出明显的双峰(一条为野生型峰形,一条为突变型峰形)并报告为“利福平耐药阳性”。当混合物中突变菌DNA含量少于1%时,则视为超出Xpert Ultra的耐药检测限。对于其他类型突变的混合物虽不如S531L敏感,但当含量高于20%~40%时,可确切地检测到含rpoB突变体DNA的混合物中的RRDR突变。
关于Xpert Ultra检测的兼容性,研究者选择了22株IS6110序列不同拷贝数的菌株进行检测,其中包括MTB临床菌株、标准菌株H37Rv、牛分枝杆菌(M.bovis)和M.bovis卡介苗(BCG),结果均为阳性[26],表明Xpert Ultra对结核分枝杆菌复合群中不同菌种的检出具有良好的兼容性。
6.Xpert Ultra检测的特异性和排他性:对于Xpert Ultra 检测的特异性和排他性,研究者将临床相关的106CFU/ml 非结核分枝杆菌(NTM,包含结核分枝杆菌,鸟分枝杆菌,胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌)或环境污染的分枝杆菌同50 CFU/ml MTB标准株混合,每种混合物一式三份进行测试,检测结果均为MTB阳性且对利福平敏感,表明NTM的高浓度混杂不会明显干扰Xpert Ultra检测MTB的效能。检测临床痰标本时,以培养结果作为参考,Xpert Ultra的敏感度较Xpert更高,但特异度差异无统计学意义[22]。另外,Xpert Ultra检测盒可在Xpert检测盒使用的GeneXpert平台上运行,对于资源有限的国家,每个检测盒的优惠价格将保持不变(约10美元)[28]。
Xpert Ultra作为新一代智能MTB检测试剂盒,虽然相对于Xpert检测样本的敏感度有所提升,如在痰液标本中LOD从Xpert的112.6 CFU/ml菌落下降到Xpert Ultra的15.6 CFU/ml[26],但Xpert和Xpert Ultra检测的最新对比研究表明,Xpert Ultra敏感度的提高是以降低患者特异度为代价的[29]。还有一些研究数据显示,Xpert Ultra检测的特异度低于Xpert,下降的原因可能主要出现在患者治疗后期,其痰液等标本中非活性MTB被系统识别,而造成了部分假阳性结果[23]。这就意味着,临床医生在参考复治患者实验室检查结果时,需要进一步结合临床病史、症状体征,以及其他实验室检查。
理论上讲,Xpert Ultra检测的高敏感度应该会影响公共卫生健康的关键指标,如开始治疗的患者例数及死亡率。但与涂片抗酸染色镜检相比,尽管Xpert Ultra的敏感度大幅度提高,但在衡量Xpert Ultra对患者死亡率影响的研究中显示,其对公共卫生的贡献并没有体现出应有的价值[30-31];同时,Xpert Ultra的广泛使用应该会增加就诊患者的检出率,进而增加抗结核治疗患者的数量,但目前的研究结果显示影响程度并不大[32-33],具体影响还需进一步进行系统评估。
虽然Xpert Ultra在国内并未上市,但Xpert在国内的检测中的确存在对EPTB与涂阴结核标本的检测敏感度不足的问题。比如国内的报道中,张爱梅等[34]研究Xpert在EPTB标本的数据显示,以细菌培养为金标准时Xpert检测的敏感度为53.8%,其中涂阴组的敏感度仅为34.6%。以临床诊断为参考标准,孙庆燕等[35]的研究显示,Xpert在EPTB患者中的检出率仅19%;张炜平和秦超[36]的研究显示,Xpert在涂阴PTB痰标本中的检出率为48.57%。张海晴等[37]在Xpert对4个TB高负担国家疑似PTB患者痰标本检测的分析中显示,涂阳组检出率为98.2%(551/561)、涂阴组为72.1%(124/172),且复检可提高涂阴组检出率。所以,Xpert Ultra技术针对国内涂阴和EPTB患者的少菌型样本的检测效果值得期待,预测会体现在患者病程中提早报告菌阳、减少重复检测次数、降低支出成本等方面。
综上所述,Xpert Ultra的应用可提高TB患者的检出率,尤其是PTB并发HIV感染者、儿童结核病和EPTB等荷菌量较低的患者。随着临床抗结核药物的应用和发展,从患者处所获标本逐渐向少菌型发展,在这种情况下,提高检测方法的敏感度将更有助于确定TB患者,为实现根除TB的目标奠定坚实的基础。
[1] World Health Organization. Use of high burden country lists for TB by WHO in the post 2015.Geneva: World Health Organization,2015.
[2] Mulder C,Mgode GF,Ellis H, et al.Accuracy of giant African pouched rats for diagnosing tuberculosis: comparison with culture and Xpert®MTB/RIF. Int J Tuberc Lung Dis, 2017,21(11):1127-1133.
[3] Campos LC, Rocha MV, Willers DM, et al. Characteristics of Patients with Smear-Negative Pulmonary Tuberculosis (TB) in a Region with High TB and HIV Prevalence. PLoS One,2016,11(1):e0147933.
[4] World Health Organization. Global tuberculosis report 2017. Geneva: World Health Organization,2017.
[5] Tostmann A, Kik SV, Kalisvaart NA, et al. Tuberculosis transmission by patients with smear-negative pulmonary tuberculosis in a large cohort in the Netherlands. Clin Infect Dis, 2008,47(9):1135-1142.
[6] World Health Organization. Xpert MtB/RIF assay for the dia-gnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. Geneva: World Health Organization,2014.
[7] Helb D,Jones M,Story E,et al. Rapid Detection ofMycobacteriumtuberculosisand rifampin resistance by use of on-demand, near-patient technology. J Clin Microbiol, 2010, 48(1):229-237.
[8] García-Basteiro AL,Saavedra B,Cobelens F.The Good,the Bad and the Ugly of the Next-Generation Xpert Mtb/Rif®Ultra Test for Tuberculosis Diagnosis. Arch Bronconeumol, 2017,53(12):665-666.
[9] Steingart KR,Schiller I,Horne DJ, et al.Xpert®MTB/RIF assay for pulmonary tuberculosis and rifampicin resistance in adults. Cochrane Database Syst Rev, 2014,(1):CD009593.
[10] Akanbi MO,Achenbach C,Taiwo B, et al. Evaluation of gene Xpert for routine diagnosis of HIV-associated tuberculosis in Nigeria: A prospective cohort study. BMC Pulm Med, 2017,17(1):87.
[11] Lawn SD,Brooks SV,Kranzer K, et al.Screening for HIV-associated tuberculosis and rifampicin resistance before antire-troviral therapy using the Xpert MTB/RIF assay: a prospective study. PLoS Med, 2011, 8 (7):e1001067.
[12] Sohn H,Aero AD,Menzies D, et al. Xpert MTB/RIF testing in a low tuberculosis incidence, high-resource setting: limitations in accuracy and clinical impact. Clin Infect Dis, 2014,58(7):970-976.
[13] Yuan M,Lyu Y,Chen ST,et al. Evaluation of Xpert MTB/RIF for the Diagnosis of Extrapulmonary Tuberculosis in China. Biomed Environ Sci, 2016, 29(8): 599-602.
[14] Maynard-Smith L,Larke N,Peters JA,et al.Diagnostic accuracy of the Xpert MTB/RIF assay for extrapulmonary and pulmonary tuberculosis when testing non-respiratory samples: a systematic review. BMC Infect Dis, 2014, 14:709.
[15] Rice JP,Seifert M,Moser KS, et al. Performance of the Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary tuberculosis and rifampin resistance in a low-incidence, high-resource setting. PLoS One, 2017, 12(10):e0186139.
[16] Albert H,Nathavitharana RR,Isaacs C,et al.Development, roll-out and impact of Xpert MTB/RIF for tuberculosis: what lessons have we learnt and how can we do better? Eur Respir J, 2016,48(2): 516-525.
[17] Huang H, Zhang Y, Li S, et al. Rifampicin Resistance and Multidrug-Resistant Tuberculosis Detection Using Xpert MTB/RIF in Wuhan, China: A Retrospective Study. Microb Drug Resist, 2017. In press.
[18] Zetola NM, Shin SS, Tumedi KA,et al. MixedMycobacteriumtuberculosiscomplex infections and false-negative results for rifampin resistance by GeneXpert MTB/RIF are associated with poor clinical outcomes. J Clin Microbiol,2014, 52(7):2422-2429.
[19] Rufai SB, Kumar P, Singh A, et al.Comparison of Xpert MTB/RIF with line probe assay for detection of rifampin-monoresistantMycobacteriumtuberculosis. J Clin Microbiol, 2014, 52(6): 1846-1852.
[20] Köser CU,Feuerriegel S,Summers DK,et al. Importance of the genetic diversity within theMycobacteriumtuberculosiscomplex for the development of novel antibiotics and diagnostic tests of drug resistance. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(12): 6080-6087.
[21] Cayci YT,Bilgin K,Coban AY,et al.An evaluation of false-positive rifampicin resistance on the Xpert MTB/RIF. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2017,112(11): 756-759.
[22] Williamson DA,Basu I,Bower J, et al.An evaluation of the Xpert MTB/RIF assay and detection of false-positive rifam-picin resistance inMycobacteriumtuberculosis. Diagn Microbiol Infect Dis,2012,74(2):207-209.
[23] World Health Organization.WHO meeting report of a technical expert consultation: A multicentre non-inferiority analysis of Xpert MTB/RIF ultra compared to Xpert MTB/RIF, 2017.Geneva: World Health Organization,2017.
[24] Bahr NC, Nuwagira E, Evans EE, et al. Team A-CT. Diagnostic accuracy of Xpert MTB/RIF Ultra for tuberculous meningitis in HIV-infected adults: a prospective cohort study. Lancet Infect Dis,2018,18(1):68-75.
[25] Kendall EA, Schumacher SG, Denkinger CM, et al. Estimated clinical impact of the Xpert MTB/RIF Ultra cartridge for diagnosis of pulmonary tuberculosis: A modeling study. PLoS Med,2017,14(12):e1002472.
[26] Chakravorty S,Simmons AM,Rowneki M,et al. The new Xpert MTB/RIF Ultra: improving detection ofMycobacteriumtuberculosisand resistance to rifampin in an assay suitable for point-of-care testing.MBio,2017,8(4): pii: e00812-817.
[27] Chakravorty S, Kothari H,Aladegbami B,et al. Rapid, high-throughput detection of rifampin resistance and heteroresistance inMycobacteriumtuberculosisby use of sloppy molecular beacon melting temperature coding. J Clin Microbiol, 2012, 50(7): 2194-2202.
[28] World Health Organization. Frequently asked questions about the WHO Technical Expert Consultation findings on Xpert®MTB/RIF Ultra.Geneva: World Health Organization,2017.
[29] Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND). A multicentre non-inferiority diagnostic accuracy study of the ultra assay compared to the Xpert MTB/RIF assay. Geneva: Foundation for Innovative New Diagnostics, 2017.
[30] Cox HS,Mbhele S,Mohess N,et al. Impact of Xpert MTB/RIF for TB diagnosis in a primary care clinic with high TB and HIV prevalence in South Africa: a pragmatic randomised trial. PLoS Med, 2014, 11(11):e1001760.
[31] Churchyard GJ,Stevens WS,Mametja LD,et al. Xpert MTB/RIF versus sputum microscopy as the initial diagnostic test for tuberculosis: a cluster-randomised trial embedded in South African roll-out of Xpert MTB/RIF. Lancet Glob Health,2015,3(8): e450-457.
[32] Durovni B, Saraceni V,van den Hof S,et al. Correction:Impact of Replacing Smear Microscopy with Xpert MTB/RIF for Diagnosing Tuberculosis in Brazil: A Stepped-Wedge Cluster-Randomized Trial. PLoS Med,2015,12(12): e1001928.
[33] Sachdeva KS,Raizada N,Sreenivas A,et al.Use of Xpert MTB/RIF in Decentralized Public Health Settings and Its Effect on Pulmonary TB and DR-TB Case Finding in India. PLoS One,2015,10(5): e0126065.
[34] 张爱梅,李峰,刘旭辉,等.结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测在肺外结核中的诊断价值.中华传染病杂志,2016,34(3):174-179.
[35] 孙庆燕,孙冰,张娟. GeneXpert MTB/RIF在诊断肺内及肺外结核病的应用评价.医学检验与临床,2017,28(10):27-30.
[36] 张炜平,秦超. 支气管肺泡灌洗液 Xpert MTB/RIF检验在痰涂阴肺结核发现中的价值. 中国生化药物杂志,2017,37(2):302-304.
[37] 张海晴,刘成永,周冬青,等.GeneXpert MTB/RIF系统在结核性胸膜炎快速诊断中应用价值.北京医学,2016,38(7):739-741.