提高结核抗体试剂质量 加强临床筛选评估研究

吴雪琼

·述评·

提高结核抗体试剂质量加强临床筛选评估研究

吴雪琼

全球结核病(TB)疫情依然相当严重。根据WHO 2017年报告，2016年全球有1040万例TB患者、49万例耐多药结核病(MDR-TB)患者和11万例单耐利福平的TB患者；只有57%的肺结核患者是经细菌学证实的，自2013年以来菌阳患者逐年减少，合计167.4万例患者死于TB[1]。中国的TB疫情相当严重，2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果表明，15岁及以上人群肺结核的患病率为459/10万，其中涂阳肺结核患病率为66/10万，菌阳肺结核患病率为119/10万，由此可见，我国50%以上为菌阴肺结核患者[2]。

显然目前临床上常规应用的病原学检查方法(涂片、培养和基因扩增)均不能满足菌阴结核病早期诊断和鉴别诊断的需要[3-4]。而免疫学检查方法从宿主的免疫应答角度间接地反映了结核分枝杆菌(MTB)的感染，而且血液标本来源方便，检测简便、快速，已成为结核病尤其是菌阴肺结核、肺外结核和儿童结核病辅助诊断的重要手段[3,5-6]。但目前国际上对结核抗体的诊断价值存在诸多争议，《中国防痨杂志》编辑部于2017年6月30日在湖北省宜昌市召开了结核抗体检测专家共识讨论会，以期阐明问题之所在，探索解决之办法，指导临床之应用。笔者概要地介绍了结核感染者的体液免疫应答，及结核抗体检测试剂的临床诊断表现，并进一步探讨存在的问题和未来发展的前景。

结核感染者的体液免疫应答

MTB感染人体后，其细胞壁抗原和在体内生长、代谢过程中产生的蛋白质、糖脂类抗原，均可诱导人体B淋巴细胞产生具有免疫活性的免疫球蛋白(immunoglobulin， Ig)，即抗体。这些抗体是一类重要的免疫效应分子，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害，使病原体失去致病作用。此外，抗体通过与细胞免疫的相互作用，在抗结核免疫中发挥重要作用。抗体根据其结构主要分为5种类型：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。IgG占血清总Ig的70%～75%，在机体免疫防护中发挥重要的抗感染作用，并且随病变加重而增强，持续时间长；因此，IgG一直是临床检测抗结核抗体的主要类型。IgM占血清总Ig的5%～10%，是初次体液免疫应答中出现最早的抗体，是机体抗感染的“先头部队”，但持续时间短，是近期感染的标志；因此，活动性TB患者中IgM阳性率低[7]。IgA占总Ig的10%～20%，其中以血清型IgA为主，有介导、调理吞噬和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)作用。IgE在血清中的含量很低，与肺结核的严重程度具有一定的相关性。IgD在血清中的含量极低，主要以膜结合形式存在于成熟的B淋巴细胞表面，在B细胞分化发育中发挥重要的调节作用，在抗感染中也发挥一定的作用[8]。

临床上TB患者免疫功能紊乱，表现为辅助性T淋巴细胞(Th)1和Th2免疫应答失衡，Th1型免疫应答先增强、而后逐渐减弱，Th2型免疫逐渐增强，使Th1型免疫向Th2型免疫转移，表现为血清抗体逐渐增高[9]。因此，抗体水平增高是MTB活动感染的标志，MTB潜伏感染一般抗体水平不高[9-10]。抗体存在于各种体液标本中，如血清、胸腔积液、脑脊液、腹腔积液、关节腔积液、尿液等，由于血清是主要的检测样品，因此又称为血清学检测。抗体检测对活动性TB具有辅助诊断价值，尤其是对于那些诊断困难的菌阴肺结核、儿童结核病或肺外结核(如脊柱结核)具有实用价值[3,11]。

结核抗体检测取得的主要进展

1.抗体检测技术的发展：1898年Arloing等发明了血凝集试验；1976年Engvall和Perlmann发明了酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)技术；20世纪90年代胶体金技术问世；近年来化学发光标记系统、液晶光学传感器、磁珠微芯片ELISA、电化学检测、免疫PCR试验等[12-14]诸多新技术问世，使检测敏感度显著提高。

2.抗原的发展：抗体检测所用抗原从最初的菌裂解液、培养滤液蛋白至纯蛋白衍化物、纯化的糖脂抗原、纯化的天然蛋白抗原，最后发展为纯化的重组蛋白抗原；从单一抗原到多种抗原(如多点抗原组合、混合抗原、融合抗原、表位串连抗原)[15-17]。

3.检测抗体类型的发展：从IgG单一抗体类型检测发展为与 IgM、IgA和IgE的联合检测或混合检测[7,18]，以提高检测的敏感度。

4.检测标本的扩展：从血清标本检测到体液标本检测，体液标本从胸腔积液、脑脊液、腹腔积液进展到检测尿液中抗结核抗体[19]。同种抗原同时检测血清和尿中抗结核抗体的敏感度和特异度相当，差异无统计学意义；但血抗体与尿抗体检测的一致性差；两种标本同时检测可起互补作用，显著提高检测的敏感度。

结核抗体检测试剂的临床诊断表现及存在问题

目前已有许多商业化的结核抗体试剂盒在临床应用，绝大多数是检测血清抗体IgG，少数是检测IgM和IgA[7,18]，但其诊断TB的效能差异极大，大多数试剂盒的临床诊断表现不能满足临床需求。2008年WHO 对19个商业化TB血清抗体检测试剂盒进行实验室评价，其敏感度和特异度分别为1%～60%和53%～99%[20]。Steingart等[21]对1990—2010年商业化血清抗体检测试剂的研究文献进行系统综述与Meta分析，结果显示其中67个肺结核诊断研究的敏感度和特异度分别为0%～100%和31%～100%；25个肺外结核诊断研究的敏感度和特异度分别为0%～100%和59%～100%。国内来自不同医院对不同商业化结核抗体试剂盒的临床评价结果也证实抗体试剂盒在临床上的表现差异极大[7,22-25]。

分析产生上述结果的原因可能存在下列几个方面的问题：

1.试剂盒质量不稳定：这是目前商业化抗体检测试剂在临床应用不理想的最主要的问题。生产厂家对试剂盒的原材料、生产工艺和质量控制不严格，对试剂盒的2个关键评价指标(敏感度和特异度)缺乏合理的控制，过高的敏感度可能导致特异度降低，过高的特异度可能导致敏感度下降。此外，抗原的制备方法、纯度、浓度、活性也影响试剂盒的质量[26]；部分厂家外购抗原，质量不可控，一般应用MTB天然抗原检测抗体的敏感度高于大肠埃希菌表达的MTB重组蛋白[27]，这可能是因为天然抗原活性较高，而大多数大肠埃希菌表达的重组蛋白抗原为非可溶性[28]，其空间构象可能发生某些变化而影响了其反应性。抗原纯度不高也会导致与其他细菌抗原产生交叉反应而影响特异度；抗原浓度过低可影响检测的敏感度，而抗原浓度过高可影响检测的特异度。

2.抗原的选择不同：不同的试剂盒所选择的MTB抗原并不完全相同，目前已发现活动性TB患者血清只能识别大约10%的MTB蛋白，对不同MTB抗原产生不同水平的抗体[3]；而同一例患者在疾病的不同阶段对不同抗原的免疫反应也不同。随着疾病的发展，MTB在体内增殖、代谢，体液免疫应答会从聚焦膜相关抗原转向细胞外蛋白抗原，使得每一例患者血清识别抗原的种类、数目和水平都有很大的差异，抗原识别的个体差异是人类TB体液免疫的主要特性[29]。Kunnath-Velayudhan等[9]通过MTB蛋白质组芯片检测人血清中抗结核抗体，才发现13个与活动性TB相关的蛋白。目前，结核抗体试剂盒大多数选择相对分子质量为38 000(以下采用“38 kD”表示)和相对分子质量为16 000(以下采用“16 kD”表示)的免疫显性抗原，通常免疫显性蛋白抗原均含有较多的B细胞表位。少数膜蛋白既可能来源于活菌和死菌，也可能来源于巨噬细胞外泌体，而可能被潜伏感染者、活动性TB患者和非TB患者血清识别导致假阳性结果。选择的抗原若与其他细菌、尤其是环境中非结核分枝杆菌有交叉反应也易产生假阳性结果[30]。因此，选择多个高敏感度、高特异度并有互补性的特异性抗原进行组合或融合对于TB的血清学诊断是非常重要的[31-32]。

3.体内MTB含量及代谢状态不同：人体受MTB感染后，从临床角度可分为2个阶段，即潜伏感染和活动性TB；从MTB代谢角度可分为3个阶段，即休眠状态、增殖状态(活动性感染)和活动性TB。近年来的研究表明，感染的MTB菌株不同、生长状态不同则表达的蛋白也不完全相同[33]，细胞壁抗原和细胞外蛋白主要诱导抗结核抗体的产生，而大多数潜伏期蛋白不诱导抗体产生，抗体水平与体内MTB感染的进展、MTB含量及其复制状态相关[9,34]；通过研究MTB感染不同阶段机体的体液免疫应答可了解宿主与MTB斗争的历程。笔者[35-36]以前的研究和Zhang等[11]的研究均发现：菌阳TB患者抗体水平高于菌阴TB患者，活动性TB患者高于结核潜伏感染者，PPD试验阳性健康人群抗体水平高于PPD试验阴性健康人群和卡介苗接种的健康人群。Kunnath-Velayudhan 等[9]和Steingart等[21]的研究均证实体内细菌载量会增加抗体的反应性，这可能是因为各试剂盒所选择的抗原大多是细胞增殖期的细胞外蛋白或细胞壁抗原，MTB活跃增殖时表达的抗原增多，在体内菌量较少时这些抗原也较少，而MTB潜伏、休眠时这些增殖期抗原表达少或不表达。但也有少数的研究显示菌阳和菌阴TB患者的抗体水平比较，差异无统计学意义[7,36]。大多数MTB休眠相关抗原一般不诱导机体产生抗体[10,37]。因此，结核抗体可作为MTB活动感染、进展的标志物[38-39]。应用高质量的结核抗体检测试剂在人群中大规模筛查活动性TB，不仅较γ干扰素释放试验具有较高的敏感度和特异度，而且操作更简便、成本更低廉[40]。

4.有TB病史和胸部X线表现异常的非TB患者是导致假阳性的主要原因之一[9]：TB患者已治(自)愈后结核抗体仍存在较长时间(12～15个月)[41]，这可能是部分患者体内MTB未完全清除，仍在少量不定期增殖所致。Feng 等[18]的研究显示，化疗前和化疗1～6个月后结核抗体水平的差异无统计学意义。因此，结核抗体检测不能作为TB疗效判断的指标(如好转、治愈)，也不能作为TB复发的诊断依据。但也有一些研究显示化疗后抗体水平下降。

5.检测技术性能不同：目前，我国临床常用的结核抗体检测试剂盒大多数采用胶体金抗体检测技术(如胶体金渗滤法、胶体金免疫层析法)[3,7,22-25]，方法简便、快速，且无需特殊仪器而易在临床上广泛开展，但其敏感度低；少数采用ELISA、化学发光标记系统等敏感度较高的、半定量的检测技术，能获得敏感度较高和准确的结果。

6.一个抗体检测试剂盒无法满足所有年龄段的检测需求[42]：成人和婴幼儿的免疫状况不同，成人的诊断界限值不一定适合于婴幼儿。

7.试剂盒选择的问题：大多数临床检验科选择试剂盒时较盲目，缺乏科学的评估，对其诊断性能不太了解。

8.临床评价设计不合理：采用抗体辅助诊断是为了弥补细菌学检测的不足，若以细菌学检查为金标准评价免疫学方法，则使高敏感度的免疫学检测出现大量“假阳性”结果，不能体现免疫学检测的优势，造成大量菌阴肺结核患者的漏诊。因此，WHO 推荐“准确的微生物或分子检测方法”的建议不能完全解决临床存在的现实问题。此外，许多试剂盒在临床评价时，只纳入健康人群作为阴性对照组，不能客观反映试剂的特异度，在健康人群中检测的特异度明显高于非结核呼吸疾病患者，假阳性大多来自非结核呼吸疾病患者。因此，必需纳入非结核呼吸疾病人群，以排除呼吸道常见细菌和病毒感染的干扰。

9.临床医生对结核抗体的诊断能力期望值高：免疫学指标是根据宿主对MTB产生的免疫应答进行检测的，存在较大的个体差异，不如可作为诊断金标准的细菌学指标直接检测病原菌所具有的高特异度。因此，临床医生不要对此期望过高，免疫学检测只是辅助诊断指标。

展 望

结核抗体检测应用于临床已有40多年的历史，结核抗体检测的研发也已形成一定规模的生物技术产业，但在临床诊断上的总体表现不佳，并未达到预期的效果[23，25]，未能发挥其应有的对TB辅助诊断的作用。2011年WHO“鉴于商业化血清学检测试剂敏感度和特异度高度可变，存在大量假阳性、假阴性结果，产品质量低，强烈呼吁停止血清学检测用于肺结核、肺外结核的诊断”。面对上述存在的问题，建议未来采取以下应对措施：(1)生产厂家严把产品质量关；(2)国家监管部门加强上市产品的监管；(3)实验室应对试剂盒定期评估和选择，为临床提供准确、可靠的实验结果是结核实验室的职责；(4)抗体检测技术及方法尚需不断地发展、完善：如开展新的抗原、标记物、检测技术等的研究。

随着MTB致病机制的进一步阐明、对人类与MTB相互作用的免疫应答机制的深入了解，以及我国企业产业化水平的不断提高，相信结核抗体检测在临床上将能发挥其应有的作用。

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薛爱华)