人羊膜间充质干细胞旁分泌与自分泌作用的研究进展

骆雪，李文晶，李天舒，王蔚

（中国医科大学附属口腔医院综合科，沈阳 110002）

间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSC）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，且为同种异质群体，国际细胞治疗学会对其定义的最小标准为：细胞黏附贴壁生长；高表达CD73、CD90和CD105，低表达CD11b、CD14、CD19、 CD79a、 CD34、 CD45和HLA-DR；可以在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞［1］。人羊膜MSC （human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs） 是MSC的独特种群，来源于胎盘羊膜，同来源于骨髓、脂肪、脐带血、羊水、外周血及其他组织的MSC相似。hAMSCs含量丰富，收集和获得相对容易，几乎不存在伦理学争议。hAMSCs不表达端粒酶，具有多重分化潜能［2］、低免疫原性和低瘤性，其低瘤性不受冷冻保存的影响［3］，低免疫原性和低瘤性为hAMSCs的同种异体移植提供了可能。最近的研究［4］表明，hAMSCs具有免疫调节功能，包括影响T细胞增殖，抑制树突状细胞改变和成熟；还可以抑制几种免疫细胞的活性和功能，抑制脂多糖 （lipopolysaccharides，LPS） 刺激单核巨噬细胞 （mononuclear macrophage，THP-1） 分泌肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factor α，TNF-α） 和白细胞介素1β （interleukin 1 beta，IL-1β） 。基于以上优势，hAMSCs被广泛应用于组织工程学与再生医学领域。

1 hAMSCs的临床应用

临床研究结果显示，hAMSCs对促进伤口愈合及血管再生等有显著作用，因其具有多重分化潜能被广泛应用于心力衰竭、糖尿病、脑梗死等疾病的治疗。

1.1 心脏疾病

成人心肌细胞几乎没有再生能力，hAMSCs可以分化为心肌细胞，所以hAMSCs成为心脏再生治疗的一种理想的治疗方法，用于治疗严重心力衰竭［5］。动物实验证实，将hAMSCs移植入心肌梗死的大鼠后，hAMSCs进入心脏并分化为心肌样细胞［6］。

1.2 糖尿病

目前，胰岛素是治疗糖尿病的主流方法，但是胰岛素治疗带来的免疫排斥反应和胰岛素供应不足阻碍了它的广泛使用。文献［7］报道，可以通过移植MSC治疗I型糖尿病，逆转高血糖现象。研究［8-9］发现，将端粒酶反转录酶基因电转染的hAMSCs移植到糖尿病大鼠模型后，大鼠血糖得到明显控制，胰岛损伤减轻，糖尿病得到了有效治疗。刘亮等［10］发现，葛根芩连汤联合hAMSCs协同治疗糖尿病早期并发症——视网膜病变也有显著的疗效。

1.3 其他应用

移植的hAMSCs可以在大鼠脑梗死区域定殖、存活并分化为神经元样细胞，改善脑梗死带来的神经损伤现象。将羊膜MSC移植至局灶性脑缺血的动物模型中，缺血区域神经元样细胞显著增多，神经损伤得到良好的修复，因此，hAMSCs移植成为治疗脑血管损伤类疾病的一种新型治疗手段。hAMSCs还可以通过旁分泌机制和免疫调节持续改善阿尔茨海默病的病理和记忆功能［11-14］。此外，移植hAMSCs还能抑制顺铂化疗所致的骨髓损伤，改善骨髓抑制所致造血功能障碍。

2 hAMSCs的旁分泌与自分泌作用

研究［15］证实，干细胞发挥再生作用主要是通过旁分泌与自分泌途径。hAMSCs是一种特殊的MSC，其旁分泌与自分泌作用与MSC类似。旁分泌是指细胞产生的激素或调节因子通过细胞间隙对邻近的其他细胞 （同种或异种） 起调节作用。MSC的旁分泌作用可分为营养、免疫调节、抗瘢痕形成和化学趋化。MSC的营养作用又可以进一步细分为抗凋亡、刺激有丝分裂、支持器官内在前体的增殖、分化及血管生成。自分泌是指分泌的细胞因子主要作用于产生细胞因子的细胞本身，调节细胞自身和邻近同类细胞的活性，多数在局部发挥效应。MSC的旁分泌与自分泌作用主要是通过大量已知的细胞因子进行调节。细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，通过与相应受体结合，调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。有研究［16-17］发现MSC不仅可以影响T细胞，还可以通过旁分泌作用抑制或促进B细胞增殖，抑制自然杀伤细胞 （natural killer cell，NK） 细胞活化，并调节树突状细胞和巨噬细胞分泌细胞因子。

MSC的旁分泌与自分泌作用在组织修复中起重要作用。在组织损伤的第一阶段，MSC分泌肝细胞生长因子 （hepatocyte growth factor，HGF） 、血管内皮细胞生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 、转化生长因子β （transforming growth factor β，TGF-β） 、碱性成纤维细胞生长因子 （basic fibroblast growth factor，bFGF，又称FGF2） 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 （granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF） 增多［17］，这些细胞因子能够促进其他细胞生长、血管再生、抗纤维化、抗凋亡，促进自身分化为成纤维细胞及血管内皮细胞等。

hAMSCs可以分泌多种细胞外基质、细胞因子、生长因子及生物活性蛋白［18］。实时PCR检测结果显示，-80 ℃保存1个月的人羊膜中仍可见8种生长因子［EGF，TGF-α，角质细胞生长因子 （keratinocyte growth factor，KGF） ，HGF，bFGF，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3］和2种生长因子受体 （KGFR、HGFR）mRNA的表达。庞希宁等［19］发现hAMSCs含有丰富的线粒体、高尔基体和粗面内质网，提示hAMSCs具有大量分泌蛋白质的能力，从形态学结构基础特征方面为hAMSCs的旁分泌与自分泌作用提供了证据。

2.1 hAMSCs分泌的细胞因子

2.1.1 EGF：EGF是调节糖酵解、蛋白质磷酸化、细胞钙代谢的重要单链多肽生长因子，可以诱导分泌骨形态发生蛋白2、VEGF、白细胞介素8 （interlukin-8，IL-8）、表皮生长因子1和2 （eprthelial growth factor-1/2，EGR-1/2） 的表达［15］，促进细胞增殖、表皮再生、血管形成，刺激表皮细胞合成分泌透明质酸，促进结缔组织细胞的生长［20］。EGF能在mpBM-MSC中激活表皮生长因子受体信号通路［21］，影响细胞增殖、凋亡和迁移。EGF还可以作用于hAMSCs自身，促进体外培养hAMSCs的迁移［22］。

2.1.2 HGF：HGF是一种多功能间充质来源的细胞因子，具有强大的促进血管生成、促进细胞侵袭和迁移［23］、抗凋亡和神经再生效应［24］。文献［25］报道，HGF/Met （酪氨酸激酶受体） 能拮抗TGF-β1，预防纤维化，调节心肌细胞自噬，在组织损伤后的心血管重塑中起重要作用，但也有学者［26-28］发现激活HGF/Met会促进癌细胞的增殖和扩散，增加其侵袭性。近年来，HGF被应用于多种疾病的治疗，如通过抑制血管内皮细胞凋亡治疗慢性阻塞性肺病，减轻神经病理性疼痛，修复鼠面部挤压伤所造成的面神经损伤，延缓慢性肾脏病纤维化进展，治疗动脉硬化引起的严重肢体缺血［24，29-32］。

2.1.3 TGF-β：TGF-β能够促进蛋白酶抑制剂的合成，上调细胞黏附分子，抑制基质蛋白酶的合成，刺激细胞外基质蛋白的合成及沉积，被认为是在伤口愈合过程中控制成纤维细胞活性中最有影响力的生长因子［28］。BENGHUZZI等［33］研究发现，低浓度TGF-β1可以有效促进伤口愈合并预防手术修复中肌腱的纤维化。临床上可以通过抑制部分TGF-β的作用，治疗肝纤维化、病理性瘢痕等［34-36］。TGF-β是一种免疫抑制性细胞因子［14］，在肿瘤形成早期能抑制肿瘤增殖，但是在肿瘤形成以后TGF-β受体表达下降，肿瘤细胞逃避TGF-β的负调控作用，TGF-β反而可促进肿瘤细胞增殖、分化［37］。刘登榜等［38］发现TGF-β可以促进软骨细胞增殖、黏附及分化，对骨关节的软骨修复与重建起关键作用。TGF-β还可以通过协同其他细胞因子共同发挥作用，如协同HGF在肾脏损伤修复中发挥重要作用［39］。2.1.4 KGF：KGF是成纤维细胞生长因子家族的第7个成员，主要通过旁分泌途径发挥作用，可以促进多种组织细胞增殖、分化，促进细胞有丝分裂，抗凋亡。研究［40］证实，KGF-2在体外和体内均可促进上皮细胞增殖，加速动物模型的伤口愈合。KGF可以刺激各种组织中上皮细胞的增殖、分化和迁移，目前已成为治疗黏膜炎和静脉溃疡的临床药物［40-42］。

2.1.5 bFGF：bFGF是一种有效的血管生成因子和内皮细胞丝裂原，具有促进内皮细胞扩散、迁移和促进血管形成的能力［43］。bFGF能促进结膜上皮细胞的生长，促进眼眶植入物暴露的愈合，可以作为轻度暴露的首选治疗措施［44］。同时，bFGF对治疗形觉剥夺性近视有显著效果。bFGF还与组织修复和肿瘤血管生成相关［45］，在长期发炎的组织中发挥抗炎作用。有研究［46］发现，bFGF是促凋亡因子，慢性肺缺血诱导bFGF过表达，导致肺内皮细胞功能障碍。

2.2 hAMSCs旁分泌与自分泌作用的生物学功能

2.2.1 促进伤口愈合：KLEIN等［47］利用2组羔羊胎进行了连续的实验，发现hAMSCs能促进胎儿伤口封闭及愈合。LIU等［48］也发现向小鼠皮肤伤口注射hAMSCs有助于伤口的修复，且对伤口闭合有显著效果。研究［49］证实，hAMSCs可以通过促进表皮干细胞和毛细血管的再生促进大鼠皮肤伤口的修复，并对促进皮肤全层伤口联合放射性损伤的愈合有显著作用。KIM等［50］发现hAMSCs可以通过分泌血管生成因子、增强植入分化能力，促进糖尿病引起的慢性伤口的愈合。尤为重要的是，hAMSCs移植不存在免疫排斥，自体和同种异体移植的hAMSCs对于治疗兔皮肤缺陷的效果无明显差异。

2.2.2 促进血管再生：KIM等［51］直接移植hAMSCs至小鼠的缺血后肢，结果显示不仅移植成活率高，而且能显著促进血管生成，对改善后肢局部缺血疗效显著。WARRIER等［52］也发现，来自无血管羊膜的羊膜MSC具有促进血管生成的倾向，是需要快速血管生成的组织修复、中风和缺血性疾病治疗的理想选择。

2.2.3 抗炎症：KANG等［53］发现hAMSCs可以分泌以IL-10为代表的抗炎细胞因子，参与细胞调节，促进抗炎细胞的扩散和激活。hAMSCs能够分泌前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2） 、TGF-β和HGF，抑制免疫细胞产生炎性细胞因子。SHU等［4］也发现hAMSCs的上清液可以抑制LPS刺激THP-1产生TNF-α和IL-1β。进一步证明了hAMSCs通过旁分泌作用发挥抗炎活性。

3 hAMSCs对成骨细胞的影响

骨重建需要“耦合”、协调破骨细胞和成骨细胞的功能，第一步是破骨细胞引起的骨吸收，然后是成骨细胞的增殖、黏附、分化［54］。研究［55］表明，影响成骨细胞生长、分化及黏附的蛋白主要有骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、Runt相关转录因子2。hAMSCs可以通过旁分泌与自分泌作用促进这4种蛋白的表达。EGF可通过钙信使系统，使肌醇三磷酸的钙流入和积累增加，使胞质游离钙水平增加，胶原合成减少，同时EGF/EGFR系统是成骨细胞凋亡的负调节因子。TERAMATSU等［56］证明EGF能诱导骨髓间充质干细胞 （bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs） 分化，且刺激不同分化趋势不同，弱而短时间的刺激能抑制BMMSCs成骨分化，强烈持续的刺激则能够促进BMMSCs成骨分化。外源性人HGF能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性，还发现HGF/异种脱蛋白松质骨对成骨细胞的碱性磷酸酶活性有明显的促进作用，并能促进成骨细胞的增殖。已有研究［57］证实，TGF-β可通过调控成骨细胞的自噬性，促进成骨细胞生长，抑制破骨细胞活化，并促进破骨细胞凋亡，促进新骨形成；TNF-α在骨折愈合及骨组织重塑中的表达水平增高，如果组织缺乏TNF-α，则会导致软骨矿化延迟，影响新骨形成。王磊等［58］研究证明bFGF是一种存在于骨基质中的重要的骨生长信号调节因子，可诱导未分化的MSC分化为成骨细胞及软骨细胞，并能与骨形态发生蛋白2协同发挥更好的作用。

hAMSCs可以通过旁分泌与自分泌作用促进成骨细胞的增殖、黏附与分化，但其作用机制现在仍不明确，相关国内外文献较少。相信随着科学技术的发展以及广大学者的不断探索研究，在不久的将来就会填补这一领域的空白，阐明hAMSCs旁分泌与自分泌作用的机制，为hAMSCs的研究提供新思路，开辟新的前景。

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