嵌合抗原受体修饰T细胞治疗实体肿瘤研究进展*

孙祖俊 综述，李冬 审校

200065上海，同济大学附属同济医院 检验科

目前临床上对于恶性肿瘤的治疗手段包括外科手术、放疗、化疗等，但仍有许多恶性肿瘤治疗效果不甚理想，严重影响患者的生存期及生活质量。随着人们对机体免疫系统在肿瘤发生发展作用的深入了解以及基因工程技术的进步，免疫治疗越来越受到人们的重视，如通过体外修饰、扩增免疫细胞后回输入患者体内，利用具有抗肿瘤活性的免疫细胞消灭体内肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的[1]。其中嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor,CAR-T)成为肿瘤免疫治疗领域研究的热点，为恶性肿瘤的治疗带来新的方向，尤其在血液系统恶性肿瘤治疗领域取得了显著疗效。然而对于患者更多的实体瘤研究，由于实体肿瘤微环境中的免疫抑制分子及基质屏障的限制，虽然报道较多，但报道中CAR-T细胞治疗实体肿瘤效果依然缺乏实质性进展。本文拟就CAR-T细胞应用于实体肿瘤治疗的最新研究进展进行综述。

1 嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)基本结构

CAR的基本结构主要包括三部分：胞外抗原结合区决定其特异性，负责特异性识别靶细胞表面的特异性抗原，由单链可变区序列(single-chain variable fragment,scFv)组成；跨膜区连接胞外区和胞内区，在 T 细胞活化过程中起着重要的作用，由CD4、CD8和CD28等构成；胞内区为信号转导区，将胞外区和胞内区的信号传导结构域相偶联，由TCR/CD3ζ 链、免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ 链组成，其中含有免疫受体酪氨酸活化基序( ITAMs)[2]。

2 CAR的发展

CAR的结构受益于基因工程技术的发展而得以改进，如今已发展到第4代。第1代CAR通过绑定区上的抗原受体能够识别靶抗原并激活T细胞；第2代CAR的信号区添加了一个协同刺激分子；第3代CAR在胞内信号区整合了2个或2个以上的协同刺激分子；第4代CAR在第3代CAR的结构基础上进行了改进，通过增加编码CAR的基因及其启动子的载体提高其效应。CAR-T是指通过基因工程技术构建CAR的质粒转移到T细胞，使T细胞表面表达特定的抗原受体。CAR-T的作用机理是通过抗原结合区识别对应的抗原，通过TCRζ向胞内传导TCR样的信号，最终 T细胞能够持续活化，保持持续的增殖能力及持续分泌细胞因子的能力，从而产生强烈的免疫应答反应，对肿瘤细胞起到特异高效的杀伤[3-4]。

3 CAR-T细胞在实体肿瘤治疗中的应用

免疫治疗已成为继手术治疗、化学治疗和放射治疗之后的第四大肿瘤治疗方法，并且免疫治疗发展迅速，其主要通过提高患者的免疫系统功能，达到治疗肿瘤、抑制肿瘤复发及转移的目的。肿瘤特异性抗原受体修饰的CAR-T细胞能够特异性识别肿瘤抗原、高效杀伤肿瘤细胞。近年来CAR-T细胞在治疗肺癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌及胶质母细胞瘤等实体恶性肿瘤方面取得了显著疗效。

3.1 肺癌

肺癌是许多国家男性发病率和死亡率均占第1位的恶性肿瘤，发现时大多处于中晚期，因此失去手术治愈的机会。目前化疗是肺癌的主要治疗方法，免疫治疗在肺癌的治疗中越来越受到人们的重视。

大多数非小细胞肺癌基质成分是肿瘤相关成纤维细胞，肿瘤相关成纤维细胞通过分泌心肌营养素样细胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)产生旁分泌效应，在肺癌的发生、发展过程中起着重要作用[5]。Kakarla等[6]构建了靶向成纤维细胞激活蛋白-α(fibroblast activation protein-α,FAP)特异性CAR-T细胞，用于治疗肺癌细胞移植瘤小鼠模型。FAP CAR-T 细胞能够上调荷瘤小鼠的固有免疫，产生免疫刺激分子，如干扰素伽玛(Interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、IL-13(Interleukin-13)及IL-6等，识别并杀伤FAP阳性的靶细胞，导致肿瘤溶解，但对FAP阴性的靶细胞没有作用。另外，促红细胞生成素肝细胞癌A2(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma A2,EphA2)表达于肺癌细胞表面，是非小细胞肺癌相关的抗原，通过构建EphA2 CAR-T来治疗肺癌，平均有36.6%的T细胞表达EphA2-CAR，EphA2 CAR-T细胞能够识别并杀伤EphA2阳性的靶细胞，但对EphA2阴性的靶细胞没有作用。体内实验研究发现，以上两种CAR-T细胞都具有显著的抗肿瘤活性，当FAP CAR-T细胞和EphA2 CAR-T细胞联合使用时，双重靶向肿瘤基质细胞和肿瘤细胞，两者具有明显的协同效应，并显著延长小鼠生存期。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种跨膜糖蛋白，常常作为肿瘤发生发展的标志物。目前在中国进行的EGFR CAR-T细胞治疗11例晚期复发/难治性肺癌的Ⅰ/Ⅱ期临床研究，结果发现EGFR CAR-T细胞能够清除EGFR阳性的非小细胞肺癌患者体内的肿瘤细胞，其中有 2 名患者获得部分缓解，5 名患者获得完全缓解[7]。Wei等[8]设计的靶向前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)和粘蛋白1(mucin,MUC1)的CAR-T细胞能够识别并有效杀伤肺癌细胞，明显抑制肺癌细胞异种移植瘤的生长，当PSCA CAR-T与MUC1 CAR-T细胞联合使用后抑制肿瘤生长的效果更加显著。以上研究为CAR-T治疗肺癌的临床前应用提供了重要的实验依据，因此，CAR-T细胞疗法将来有望应用于肺癌的临床治疗。

3.2 肝癌

肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，死亡率较高，位于癌症相关死亡的第3位。目前早期患者以手术为主，辅以化疗和放射治疗，对于中晚期患者，免疫治疗已成为重要的辅助治疗方法。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染是肝硬化和肝癌发生的重要危险因素，目前使用抗HBV药物能够有效地控制HBV复制，但不能彻底清除病毒。研究发现[9]，HBV在肝细胞内以其共价闭环DNA(covalent-tiyclosed circular DNA,cccDNA)作为模板来进行复制，因此cccDNA成为抑制HBV复制的重要靶点。以cccDNA CAR-T细胞治疗感染HBV小鼠的模型研究发现，CAR-T 细胞在小鼠体内能够大量扩增，并定位于病毒感染的肝脏部位，具有显著的靶向性抗肿瘤作用，并延长小鼠生存期。Krebs等[10]构建的靶向cccDNA CAR-T细胞也能特异性识别并杀伤有HBV复制的肝癌细胞，抗肿瘤效果显著。MUC1在肝癌细胞及肝癌组织中异常表达，通过构建靶向MUC1的CAR表达框，利用重组慢病毒感染Jurkat细胞株，即MUC1 CAR-Jurkat，结果发现MUC1 CAR-Jurkat能特异性识别MUC1分子并对MUC1高表达的肝癌细胞QGY-7701造成特异性杀伤，而对MUC1低表达的正常肝细胞基本不会造成损伤[11]。以癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)为靶点的CAR-T细胞治疗CEA+肝转移瘤的Ⅰ期临床试验，结果显示具有显著的抗肿瘤效果，其中1名患者病情稳定，治疗23个月后仍存活[12-13]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC-3)在大部分肝癌中表达，但在正常肝组织中不表达，靶向GPC3 CAR-T细胞对GPC3+肝癌细胞具有靶向杀伤作用，并且在体内具有显著的抗肿瘤作用[14]。另外，GPC3-CAR-T杀伤GPC3阳性的肝癌细胞具有显著的特异性和有效性，显著抑制肝癌细胞异种移植瘤的体内肿瘤生长，并且能够抑制肝癌患者来源的GPC3阳性的移植瘤生长[15]。靶向AFP的CAR-T细胞能够选择性地脱颗粒，释放细胞因子，裂解AFP阳性的肝癌细胞；体内研究发现，瘤内注射AFP CAR-T细胞能够显著缩小肝癌细胞异种移植瘤的肿瘤体积，静脉输注AFP CAR-T细胞能够快速显著地抑制肝癌细胞异种移植瘤的肿瘤生长，并且在腹腔内肝癌细胞异种移植瘤模型中还发现，AFP CAR-T细胞也具有很强的抗肿瘤活性[16]。因此，在肝癌免疫治疗方面，CAR-T细胞疗法有望成为一种安全、高效的新型治疗手段。

3.3 结直肠癌

结直肠癌是消化道系统常见的恶性肿瘤，早期结直肠癌手术治疗是常规治疗手段，如果手术治疗不彻底，肿瘤可能复发和转移，免疫治疗在结直肠癌术后治疗中具有重要作用。

CEA是消化道系统肿瘤常见的肿瘤标志物，以CEA为靶点构建的CEA CAR-T细胞能够提高CEA阳性的直肠癌细胞抗肿瘤免疫；与CEA阴性的结肠癌细胞相比，CEA阳性的结肠癌细胞产生IFN-γ及抑制肿瘤粘附的能力明显增强[17]。临床Ⅰ期试验发现，通过静脉输注CEA CAR-T细胞治疗CEA阳性、复发、难治性并伴有肝肺转移的结直肠癌患者，10 例患者中有 7 例病情得到缓解，2 例病情稳定超过 30 周，2 例影像学诊断发现肿瘤体积缩小，大部分患者血清CEA水平显著降低并长期保持在低水平，并且发现CAR-T细胞增殖并持久存在于患者的外周血中，这说明CEA CAR-T细胞治疗结直肠癌效果显著[18]。Parkhurst等[19]采用CEA特异性CAR-T治疗结肠癌, 3 例转移性结肠癌患者治疗后血清CEA水平都显著降低，其中 1 例患者临床疗效显著，然而所有的患者都发生了严重的短暂性炎症性结肠炎，这说明大剂量CAR-T细胞诱导了毒副反应的发生。人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor,HER2/neu)表达于大部分结直肠癌组织中，Morgan等[20]靶向HER2 CAR-T细胞治疗 1 例 3 年前经历结肠切除术并伴有淋巴结浸润及肝转移的结肠癌患者，输注后几分钟患者发生了急性肺毒性反应，血压急剧降低，并于 5 天后死亡。因此，CAR-T 疗法尚未能完全证明在结直肠癌患者治疗上的安全性和有效性, 今后的研究需进一步地完善和深入，以有选择性地消灭结直肠癌细胞，减少及避免对正常组织的影响。

3.4 前列腺癌

前列腺癌在中老年男性发病率和死亡率均较高，临床上多采用保守治疗。采用免疫疗法治疗前列腺癌近年来越来越受到人们的关注。

研究发现，前列腺癌细胞膜上表达前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)，因此，PSMA成为前列腺癌诊断及治疗的重要靶点之一。Zhong等[21-22]构建的PSMA CAR-T 细胞可特异性识别并杀伤表达PSMA的前列腺癌细胞，抑制免疫缺陷小鼠异种移植瘤模型体内肿瘤的生长。Tanoue 等[23]采用HER2 CAR-T 细胞治疗前列腺癌细胞PC-3异种移植瘤，发现抑制体内肿瘤生长效果显著，并且小鼠的平均生存期延长 2 倍以上。上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一种跨膜糖蛋白，在多种肿瘤细胞中过表达。Deng等[24]研究发现，EpCAM CAR-T细胞在体内外具有很强的抗前列腺癌活性，并且EpCAM CAR-T细胞治疗能够抑制EpCAM高表达的前列腺癌细胞PC3M和EpCAM低表达的前列腺癌细胞PC3异种移植瘤的生长及转移，并显著延长小鼠的生存期。PSMA CAR-T细胞能特异识别并杀伤表达PSCA的前列腺癌细胞，特异性分泌IFN-γ及IL-2，并且CAR-T细胞自身能够增殖；体内治疗前列腺荷瘤小鼠发现，治疗组小鼠肿瘤体积显著低于对照组并且生存期明显延长[25]。临床Ⅰ期研究发现[26]，5 位前列腺癌Ⅰ期患者接受PSMA CAR-T细胞治疗后，有 2 位患者获得部分缓解，血清中PSA水平分别降低50%和70%，并维持 78 天和 150 天以上，另外 3 位患者也获得部分缓解。以上实验结果提示CAR-T 细胞将来应用于前列腺癌的临床治疗的可行性。

3.5 乳腺癌

乳腺癌是发生于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，目前已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。目前的治疗主要采用局部治疗与全身治疗并重的治疗模式，免疫治疗属于全身治疗，能够恢复和增强机体内部的抗病能力，在中晚期患者的临床治疗中得到广泛应用。

研究发现[27-28]，HER-2 CAR-T细胞能够识别并杀伤表达HER-2的乳腺癌细胞，并显著抑制甚至彻底清除人乳腺癌细胞异种移植瘤，免疫组化显示在缩小的肿瘤周围聚集大量的CD3+T细胞。以MUC-1为靶点的CAR-T 细胞对MUC1阳性乳腺癌具有特异的细胞毒性作用，并显著抑制人乳腺癌细胞异种移植瘤的生长[29]。以EGFR和MUC1双靶点设计的CAR-T细胞能够有效杀伤ErbB2阳性的乳腺癌细胞，而只有当靶细胞共表达ErbB2和MUC1时CAR-T细胞才能增殖[30]。α型叶酸受体(folate receptor-α,FRα)是一种锚定于细胞膜表面的单链糖蛋白，在正常组织表达较低，但在肿瘤组织中随着肿瘤的发展而表达升高，靶向FRα CAR-T细胞能够有效特异地杀伤中度表达FRα的乳腺癌细胞，显著抑制人乳腺癌细胞移植的免疫缺陷小鼠体内肿瘤的生长；当将人乳腺癌细胞过表达FRα基因后，FRα CAR-T能够更快速地缩小小鼠体内移植瘤的体积[31]。上述实验为CAR-T 技术应用于乳腺癌临床治疗提供了实验基础，提示CAR-T 细胞免疫疗法应用于乳腺癌临床治疗具有非常广阔的前景。

3.6 卵巢癌

卵巢癌是妇科发病率和死亡率最高的疾病，严重威胁女性的健康。目前卵巢癌治疗多以手术治疗联合化疗等综合治疗为主，但疗效欠佳，免疫治疗在卵巢癌的治疗上具有毒副作用小等许多优势。

卵巢癌相关的肿瘤抗原包括FRα、HER2、NK细胞受体NKG2D的配体(NKG2DL)、间皮素(MESO)等。Kandalaft等[32]设计的靶向FRα CAR-T细胞与卵巢癌细胞共培养，结果在表达FRα的卵巢癌细胞共培养上清中检测到高水平IFN-γ、IL-2及TNF-α的分泌；FRα CAR-T 细胞能够直接高效地裂解表达FRα的卵巢癌细胞，但对FRα阴性的黑色素瘤细胞没有作用；体内实验发现FRα CAR-T细胞治疗能够明显缩小小鼠体内卵巢肿瘤的体积，并且带有免疫共刺激分子的二代FRα CAR-T细胞比一代FRα CAR-T细胞治疗具有更好的抑瘤效果。另外，在卵巢癌肺转移小鼠模型中发现，FRα CAR-T细胞治疗14天后，所有小鼠肺转移病灶得到抑制，80%的小鼠在1月后没有复发，而对照组小鼠病情进一步恶化。在一项应用FRα CAR-T细胞治疗复发的卵巢癌细胞异种移植小鼠模型实验中发现[33]，FRα CAR-T细胞的抑瘤活性和在体内存活时间方面均优于HER2 CAR-T细胞。同时对NKG2D CAR-T细胞的抗肿瘤功能分别进行的体外和体内实验分析发现，CAR-T细胞通过分泌IFN-γ而不是GM-CSF募集巨噬细胞到肿瘤微环境，促进巨噬细胞产生IL-12，激活 T 细胞及提高机体的免疫系统功能，从而特异性溶解卵巢癌细胞，减轻体内肿瘤负荷，发挥抗肿瘤作用；此时巨噬细胞表达高水平趋化因子受体(Chemokine receptor 2,CCR2)及产生大量CCR2配体CCL2[34]。研究发现[35]，靶向NKG2DL CAR-T细胞同样具有抗卵巢癌的作用，原代人CD4+和CD8+NKG2D CAR-T细胞能有效识别并裂解NKG2DL阳性的卵巢癌细胞，引起炎症细胞因子IFN-γ和TNF-α 的释放，其表达水平与细胞表面表达NKG2DL水平成正相关，但是在NKG2DL阴性的卵巢癌细胞中并没有观察到这种活性。Koneru等[36]构建的MUC16 CAR-T细胞治疗卵巢癌患者，发现该CAR-T细胞不仅能够增强肿瘤细胞溶解，而且还能够通过分泌IL-2浸入肿瘤微环境，提高机体内源性免疫应答反应，从而达到清除肿瘤的目的。Tanyi等[37]利用靶向MESO CAR-T细胞治疗 1 例晚期复发转移的 52 岁女性卵巢癌患者，21 天后腹部和骨盆CT成像显示肿瘤有轻微的缩小，第 8 天左侧胸水检测到恶性肿瘤细胞，但在治疗后的第 21 天和 26 天未检测到恶性肿瘤细胞，另外在患者外周血、肝脏组织和腹膜取出的肿瘤组织中都检测到MESO CAR-T细胞，并且血中IL-6水平显著升高。以上的研究提示，CAR-T细胞免疫疗法将来有望应用于卵巢癌的临床治疗。

3.7 胶质母细胞瘤

胶质母细胞瘤是星形细胞瘤中恶性程度最高、最具侵袭性的颅脑肿瘤，目前治疗以手术、放疗、化疗及其他综合治疗为主，但复发率较高，预后仍不理想，免疫治疗与放化疗联合使用有助于提高疗效。

CD133是一种高度保守的跨膜糖蛋白，是许多人类恶性肿瘤干细胞表面标志物，包括恶性胶质母细胞瘤。研究发现[38]，靶向CD133 CAR-T细胞能够在体内外杀伤CD133阳性的胶质母细胞瘤干细胞。抗人单克隆抗体mAb139能够特异地识别神经胶质瘤干细胞表达的突变型EGFRvⅢ，Morgan等[39]基于mAb139设计的CAR-T细胞能特异识别EGFRvⅢ突变的神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤细胞，通过分泌大量效应细胞因子如IFN-γ等，裂解表达该突变抗原的靶细胞，具有显著的抗肿瘤效应且能在体外大量扩增，而对表达野生型EGFRvⅢ的肿瘤细胞及人正常细胞没有损伤作用。Miao等[40]设计的EGFRvⅢ CAR-T细胞能够识别表达EGFRvⅢ抗原的D-270MG 细胞，并能够迁移到D-270MG细胞诱导的小鼠胶质母细胞瘤处，显著抑制小鼠肿瘤的生长和延长小鼠的生存期。EGFRvⅢ CAR-T 细胞能够特异识别并显著杀伤表达EGFR vⅢ的神经胶质瘤细胞，当效应细胞与靶细胞比为10：1时杀伤活性达60%，同时共培养上清中检测到大量INF-γ的释放，但在EGFR vⅢ阴性的胶质瘤细胞质中没有观察到这种作用；裸鼠移植瘤实验发现EGFRvⅢ CAR-T细胞治疗组3周后移植胶质母细胞瘤开始减小，而对照组小鼠肿瘤继续生长[41]。肝素酶(heparinase,HPSE)由激活的CD4+T淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞及B淋巴细胞产生，当T淋巴细胞缺乏表达HPSE时能够降解细胞外基质主要成分硫酸乙酰肝素，因此通过基因工程设计靶向HPSE的CAR-T来降解细胞外基质，促进T细胞浸润及其抗肿瘤活性。小鼠移植胶质母细胞瘤模型实验发现，HPSE CAR-T细胞治疗组小鼠生存期明显延长，在另一组动物实验中发现HPSE CAR-T细胞治疗组小鼠肿瘤处具有更多的T细胞浸润，并且肿瘤重量也比对照组明显减轻[42]。EphA2 CAR-T细胞与胶质瘤细胞共培养24 h后，在EphA2阳性的胶质瘤细胞上清液中IFN-γ和IL-2的水平显著高于EphA2阴性的肿瘤细胞，并且EphA2 CAR-T细胞对靶细胞的细胞毒性也明显高于EphA2阴性的肿瘤细胞；体内实验发现，联合免疫缺陷的小鼠大脑内注射胶质瘤细胞 7 天后，对照组小鼠持续生长，EphA2 CAR-T细胞治疗组小鼠肿瘤消退，肿瘤部位生物体发光成像信号非常弱，治疗组小鼠生存期比对照组小鼠显著延长[43]。Hegde等[44]发现HER2/IL-13Rα2 双特异性CAR-T 可抑制神经胶质瘤细胞免疫逃逸，并且能够显著增强效应因子的活性。

此外，还有以肿瘤相关抗原神经节苷脂GD2抗原为靶点的 CAR-T细胞治疗神经母细胞瘤的临床试验[45]；以羟基脱水酶IX(carboxy-anhydrase-IX, CAIX) 抗原为靶点的CAR-T细胞治疗肾癌[46]；以MUC1为靶点的 CAR-T细胞治疗胰腺癌[47]；以MESO为靶点的CAR-T细胞用于治疗小鼠原位恶性胸膜间皮瘤[48]；以αVβ6整合素为靶点的CAR-T细胞治疗黑色素瘤[49]等大多数研究都取得了一定的临床效果。最近研究发现[50]，CAR-T 细胞联合抗PD-1抗体可以大大增强CAR-T细胞的抗肾癌效应，PD-1/CD28融合受体修饰的CAR-T细胞能够逆转PD-L1/PD-1的抑制信号，增强CAR-T细胞的治疗作用，甚至优于抗PD-1阻断抗体联用的治疗效果。

4 展 望

在以 T 细胞为基础的肿瘤过继性免疫治疗领域，CAR-T 细胞治疗的实验结果显示出明显的优越性，但是目前CAR-T 细胞免疫疗法尚未充分发挥其潜力，尤其是在中晚期实体瘤治疗方面的临床研究仍然很少，并且仅靠单一的CAR-T 细胞治疗手段并不能真正有效应对，因此，如何克服肿瘤基质屏障及免疫抑制微环境、保持CAR-T 细胞持续性杀伤肿瘤细胞的能力以及临床治疗的安全性是目前CAR-T 细胞治疗急需解决的难题。随着基因工程技术的发展以及人们对免疫与肿瘤发生发展关系的深入研究，一些关键技术和问题将会得到解决，相信CAR-T 细胞一定会在实体肿瘤的免疫治疗中发挥越来越重要的作用，CAR-T 细胞联合其他治疗方法必将成为实体肿瘤治疗既安全又有效的方法。

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