基于RNAi的转基因作物研发进展

张守路 饶力群 汪启明

摘要 转基因技术作为现代生物技术的重要组成部分，在缓解资源匮乏、提高粮食产量、保护生态环境安全、拓展农业功能等方面做出巨大贡献。RNAi是迅速发展起来的一种新兴基因阻断技术，近年来，在作物防治病虫害和品质改良方面取得了显著成效，商业化应用已成为现实。因此，基于RNAi的转基因作物研发现状越来越受到人们的关注。本文就已产业化的RNAi转基因产品、RNAi转基因植物的研究进展及对RNAi转基因作物安全评价研究展望进行综述。

关键词 核酸干扰技术；转基因作物；基因沉默；安全评价

中图分类号 S188；Q785 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）21-0003-02

Advances in Research and Development of Genetically Modified Crops Based on RNAi

ZHANG Shou-lu RAO Li-qun WANG Qi-ming *

（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128）

Abstract As an important part of modern biotechnology，genetically modified technology has made great contributions to alleviating resource shortage，increasing food production，protecting ecological environment and expanding agricultural functions. RNA interference（RNAi）is an emerging genetic blocking technology which developed rapidly. In recent years，remarkable achievements have been made in crop pest control and quality improvement，and commercial application has become a reality. Therefore，the research and development status of RNAi-based transgenic crops has attracted more and more attention. In this paper，the research progress of the industrialized RNAi transgenic products，RNAi transgenic plants and the safety evaluation research prospects of RNAi genetically modified crops were summarized.

Key words RNA interference technology；genetically modified crop；gene silencing；safety evaluation

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱导细胞内同源mRNA高效特异性降解，从而使特定基因表达受抑制或使其沉默的现象[1]。双链RNA（dsRNA）是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（single-stranded RNA，ssRNA）的降解。在ATP作用下，经过Dicer酶（一种具有RNAaseⅢ活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的dsRNA（30 bp以上）首先被降解形成21～25 bp的小分子干扰核糖核酸（short interfering RNA，siRNA），并有效地定位目标mRNA。siRNA具有特殊的结构特征，即5′端磷酸基团和3′端的羟基，其2条链的3′端各有2个碱基突出于末端。由siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）核蛋白体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。

RNAi技术具有序列的高度特异性、抑制基因表达的高效性、沉默信号的高稳定性、沉默信号的可遗传性和可传递性的特点。

1 已商业化应用的RNAi转基因植物产品

RNAi以其序列特异性的优势广泛应用于阻断或抑制基因表达，这也使得它成为转基因植物研发的强大工具。RNAi作为新型转基因技术已经在植物抗病虫害和品质改良等方面得到了广泛应用，一批RNAi转基因植物开始商业化应用。

1.1 基于RNAi的抗虫转基因植物产品

由于Bt抗虫转基因作物大面积连年种植，害虫产生了较强的抗性。因此，研发新的转基因抗虫作物刻不容缓。以表达V-ATPase dsRNA的转基因玉米喂养玉米根虫，发现根虫的该基因表达量下降，玉米根部受损程度明显降低[2]；当以表达CYP6AE14 dsRNA的转基因拟南芥和烟草喂养棉铃虫时，该基因在虫体中肠里的表达量下降，幼虫生长发育减缓[3]。此外，棉铃虫取食在棉花中表达的半胱氨酸蛋白酶后更易吸收dsRNA[4]。另外，发现参与膜受体运输的Snf7基因在玉米根虫的防治上效果更显著，孟山都公司研发的转基因玉米MON87411含有玉米根虫DvSnf7基因的dsRNA，根虫取食该转基因玉米后体内的基因就会被DvSnf7 dsRNA靶向结合并干扰，进而致死[5]。转基因玉米MON87411已在美国、巴西、日本等8个国家和地区通过转基因安全评价，并已向我国申请进口安全证书。

我国在转基因重大专项的支持下，RNAi转基因植物的研发也取得了很大进展。中国科学院微生物研究所通过RNAi抑制棉花黄萎病原真菌大丽轮枝菌中致病基因的表达，开发了抗黄萎病棉花，抗性较对照处理提高了20%以上[6]；中国科学院遗传与发育生物学研究所和南京农业大学通过RNAi技术阻断棉铃虫保幼激素合成，获得了抗虫转基因棉花，尤其对于Bt抗性棉铃虫品系有很好的防治效果[7]。

1.2 基于RNAi的品质改良转基因植物产品

苹果、马铃薯等果蔬在生产、贮藏、加工等过程中经常出现褐变现象，产生异味，损失营养，造成巨大的经济损失。科学研究发现，植物组织的褐变与多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）有关，抑制多酚氧化酶活性可以减弱作物的褐变程度。奥卡诺根特色水果公司利用RNAi技术抑制苹果体内多酚氧化酶基因（PGAS PPO suppression gene），研发了转基因苹果GD743等3个转化体，能减缓苹果褐化，已在美国和加拿大通过了转基因安全评价并已商业化应用；辛普劳公司利用RNAi技术抑制asn1和ppo5基因，研发了转基因马铃薯E12，能够减少黑斑，降低致癌物质丙烯酰胺的含量，已在美国、加拿大、澳大利亚等5个国家通过转基因安全评价和商业化应用。利用RNAi技术降低支链淀粉等物质含量，改良作物品质，已在玉米、水稻、小麦等作物中得到广泛应用，获得了一系列有产业化价值的转基因材料。

可见，RNAi已成为新型转基因植物研发的重要类型，既有国外产品陆续问世并期望进入我国市场，国内自主研发的RNAi转基因产品也不断出现。

2 RNAi转基因植物的研发进展

2.1 特异转化体构建

RNAi是转入的非编码的核酸序列，其发挥作用是依靠影响靶基因的表达而体现出来的，涉及到对靶基因表达的干扰效果以及非靶标的影响等方面。要综合考虑不同靶位点、不同干扰片段剂量和不同检测时间的干扰效果进行构建特异转化体。杨中侠等[8]通过对比试验构建了70 nL剂量CAD1位点对应的dsRNA注射到幼虫体内48 h后干扰效果最佳的RNAi沉默小菜蛾类钙粘蛋白基因体系。李 娇等[9]成功构建了注射CmCHSA-Ⅰ和CmCHSA-Ⅱ靶位点2种dsRNA 1.5 ng剂量，在96 h后作用最强的沉默稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因的体系。张淑静等[10]构建了注射针对vatp1亚基位点合成的dsRNA 100 nL剂量，在72 h后，V-ATPase H亚基mRNA表达几乎被完全抑制的沉默东方粘虫V-ATP酶H亚基的体系。Zha等[11]利用RNAi转基因水稻靶向表达褐飞虱中肠里高表达的Nltry、Nlcar和NIHT1这3个基因的dsRNA，发现褐飞虱在进食这种转基因水稻之后发生了RNAi效应，最终表现为中肠里的这3个基因的表达量明显下降。

2.2 遗传转化方法

植物遗传转化和转化体的筛选是植物基因工程的重要环节，目前在植物遗传转化中运用较多的是载体法和外源目的DNA直接转化法两大类。其中，载体法主要包括农杆菌Ti或Ri质粒介导法、叶盘法、真空渗入法、原生质体法、脂质体法、原生质球法；另外，基于载体法，新的转基因方法[12]有基于AC/DS转座系统建立的转化载体、利用噬菌体P1Cre-lox位点的特异性重组系统、利用酵母线粒体I-SceI核酸内切酶特异性诱导植物DNA双链断开引起的同源重组系统、利用双元细菌人造染色體载体系统等，可以提高转化率或转基因位点质量。Liang等[13]构建了由胚乳特异启动子启动的小麦籽粒PPO基因IR-RNAi载体（正义臂和反义臂之间插入了拟南芥FAD2的intron9），并已成功转化小麦。

外源目的DNA直接转化法包括基因枪法、化学药剂诱导法、花粉管通道法，此外，其他遗传转化方法还有显微注射法、激光微束穿刺法、多聚阳离子基因导入法等，均在不同植物上有成功的应用。卢东长城[14]实验室用基因sbeIIb和sbeI的末端编码区（约200 bp）、3′末端非编码区（3′-untran-slatedregion，3′-UTR）构建了2个Sense-RNAi载体和2个hpRNAi载体，用基因枪同时或分别转化玉米，得到了稳定遗传的高直链淀粉转基因玉米。

不管是载体法还是外源目的DNA直接转化法，RNAi的载体与传统转基因载体无明显差异，使用时要根据不同植物、不同受体等多种因素选择最佳方法。

2.3 转化体筛选方法

目前，应用于转基因植株的筛选鉴定方法主要为利用标记基因进行鉴定、分子检测和免疫技术三大类。由于RNAi转基因无表达蛋白，只能通过在DNA和RNA水平进行检测。孙重霞等[15]通过PCR、Southern杂交、半定量RT-PCR、Northern杂交、酶活筛选等分子检测方法对RNAi抑制小麦籽粒PPO转基因植株及其后代株系进行筛选。张 燕等[16]同样利用了RT-PCR、PCR方法对RNAi防治水稻条纹叶枯病植株进行了鉴定。

3 RNAi转基因植物产品的安全评价展望

随着RNAi技术在转基因作物中应用的深入和RNAi转基因作物逐渐商业化的推广，RNAi转基因技术所可能产生的风险和其产品的安全性也越来越受到人们的关注。对RNAi转基因作物的安全评价尤为重要，但目前国内尚无专门针对基于RNAi的转基因产品安全评价指南。因此，根据RNAi的转基因特性，提出几点建议。

3.1 非预期效应的出现

相对于传统转基因植物，RNAi转基因植物的安全评价与传统转基因植物要更加关注dsRNA在植物细胞内的插入位点、稳定性和序列的特异性。明确插入位点在染色体上的准确位置，确定是否会对体内基因的表达造成影响。更长周期地观察插入的干扰片段能否稳定高效地表达和遗传，建议至少跟踪观察规模种植后3代以上转基因植物的稳定性。由于核酸序列在生物体内代谢的复杂性，需要更加全面和系统地比对特异RNAi干扰序列与植物基因组序列、生物圈相关生物体以及相关微生物基因组序列的互补情况，明确是否会影响非目标基因的表达而对植物的生长代谢和品质等造成影响。

3.2 对非靶标生物的影响

RNAi转基因作物的杀虫作用方式是通过昆虫摄食进入其体内。因此，应该建立农业生态系统中生物多样性数据库，明确接触RNAi转基因作物的生物种类，并且建立这些种类生物的基因组数据库，了解与siRNA具有同源性序列的基因的表现型，以确定RNAi转基因作物的杀虫活性谱[17]。明确RNAi转基因作物是否会对土壤微生物产生影响，是否存在通过基因飘移siRNA影响其他作物的基因表达等。另外，RNAi转基因作物产品中虽然没有外源蛋白质的表达，但要按照现有转基因作物食用安全评价标准确定dsRNA是否对人体生理功能产生影响。

4 结语

基因编辑CRISPR/Cas9利用同源重组可使特定基因功能完全失活，但存在脱靶效应，且对于多倍体植物而言，基因组改造的难度很大。而RNAi操作较简便，耗时较短，在不改变基因组DNA序列的情况下抑制或降低靶基因表达。尽管RNAi技术存在抑制效率不一致等不足，但作为一种高效、特异性的基因阻断技术，在植物抗病虫害、作物品质改良及提升作物经济价值等领域的应用愈发凸显[18]。在以后RNAi转基因作物产品的研发过程中应确保干扰序列的特異性、精确控制dsRNA的剂量、杜绝对非靶标基因的影响，让RNAi 技术在生命科学应用领域发挥更加重要的作用。

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