吗啡耐受和痛敏的μ受体机制：伤害性感受器μ受体的阻断可预防耐受而不影响吗啡镇痛

前 言

阿片类镇痛药，如吗啡，仍然是处理严重的、围手术期和慢性疼痛的主要药物。在过去的几十年中，随着疼痛急剧增多，阿片类药物广泛用于疼痛管理明显增加。 在美国，阿片药物处方的增长伴随成瘾率上升，及相关死亡率急剧增高，即称为阿片流行病。长期阿片类药物使用可导致镇痛耐受，在固定药物剂量时镇痛效力逐渐减弱，且出现矛盾的阿片诱导的痛觉过敏 (OIH)。 耐受和OIH是削弱疼痛控制和剂量增加的主要驱动因素，迫切需要能减缓阿片耐受和OIH，同时又能增强阿片药物镇痛作用的新治疗策略来增加病人的安全性。

虽然阿片镇痛原理来自于结合和信号疼痛神经回路MORs，但细胞类型、以及介导耐受和OIH的受体仍然存在争议。耐受和OIH是外周和中枢神经系统的MORs在分子水平、以及在突触、细胞和通路水平复杂改变的自适应过程。因此，长期阿片类药物会改变神经元MOR功能，包括通过受体磷酸化、信号转导、多聚交联等，这可能是耐受和OIH的基础。其它研究表明神经胶质细胞，尤其是小胶质细胞，是阿片耐受性和OIH的重要贡献者。慢性阿片类物质引起小胶质细胞和星形胶质细胞活化，干扰神经胶质功能显示降低耐受性和OIH。从机制上来说，以前的研究提出神经胶质细胞表达MORs，阿片样物质与MOR结合激活小胶质细胞。但是，小胶质细胞中表达MOR缺少明确的证据，其他研究支持吗啡结合并激活小胶质细胞中Toll样受体4 (TLR4) 和MD-2信号的观点。除争议之外，最近发现TLR4敲除 (KO)小鼠中的耐受性和OIH没有变化。因此，神经元与神经胶质细胞相比的贡献，以及启动镇痛耐受和OHI的分子机制，仍然悬而未决。

阿片样物质改变MOR表达神经元的性质并连接于背根神经节、脊髓背角和脑（包括脑干下行疼痛控制系统）的伤害性回路水平。 初级传入伤害感受器的MOR作为吗啡耐受和OIH启动位点的功能有特别意义，因为这种细胞类型涉及阿片类镇痛耐受、身体依赖和促伤害感受效应的发展。持续疼痛时，在CNS环路下游，伤害感受器经历和驱动促伤害感受可塑性变化。 电生理研究已经证明阿片类药物不仅抑制伤害感受器和背角神经元之间神经传递，但也可以产生适应不良的可塑性，如长时程增强 (LTP)。阿片类物质诱导的LTP被认为是OIH关键的神经学基础，并可能导致耐受。阿片诱导的LTP的突触前和突触后来源目前尚有争议，LTP是否由伤害性感受器或脊髓神经元中的MOR激活尚不清楚。 值得注意的是，以前的报告已经发现TRPV1伤害感受器的消除不仅消除了阿片样物质诱导的LTP，但也减少耐受和OIH。鉴于本研究和其他人已经表明MORs主要由DRG中肽能的TRPV1伤害感受器表达，本文验证了这个假说，即表达在伤害感受器的MOR代表了一种重要的、在伤害性环路中驱动镇痛耐受和OIH的不良适应机制启动的易感因素。

结 果

1.吗啡耐受和OIH需要MORs参与，但小胶质细胞激活不需要

作者首先验证了是否可以通过检测小胶质细胞激活将吗啡耐受和OIH分开，与此同时，检测野生型对照组和MOR KO小鼠在吗啡处理时对小胶质细胞激活、抗伤害感受耐受和OIH的影响。在野生型小鼠中，慢性吗啡处理 （每日一次10 mg/kg剂量，或每日两次从10 mg/kg递增到40 mg/kg）产生了显着的镇痛耐受和OIH，以及明显的以CD11b密度增加为证据的小胶质细胞激活，值得注意的是，本研究发现用逐级递增剂量的吗啡处理MOR KO小鼠，显示相当明显的的小神经胶质细胞激活，但不产生OIH。

2.小胶质细胞缺乏Oprm1 mRNA转录物，MOR标记蛋白和MOR免疫源性

为了进一步调查OIH和小胶质细胞激活之间的机制关系，作者使用免疫组化 (IHC)，原位杂交 (ISH)和表达荧光标记受体 (MOR-mCherry) 的敲入小鼠来建立表达MORs细胞群。作者发现MORs表达于伤害感受神经元DRG和脊髓背角。然而，背角切片的检测并没有提供小胶质细胞中表达Oprm1 mRNA转录物（编码典型的七跨膜蛋白的MOR），抗MOR免疫源性或MORmCherry的清晰证据，如CX3CR1-GFP或CD11b免疫阳性。本研究用RNA测序(RNA-seq)转录分析了急性纯化的非培养的成年小鼠脊髓小胶质细胞。分析了编码跨膜七个蛋白质的外显子，以及选择性剪接变异体和Oprm1的截短受体的表达。与DRG不同，在纯化的脊髓小胶质细胞中没有检测到任何Oprm1转录物。RNA测序读取相反方向的Ipcef1基因部分与Oprm1重叠，但没有读取到与外显子1-4连接的Oprm1 (这是表达七跨膜蛋白的要求)。在慢性神经性疼痛小鼠或长期吗啡处理的小鼠，也检测不到小胶质细胞外显子1-4连接的Oprm1。神经元中的MOR可能驱动阿片类伤害性副作用的启动。

3.基因敲除伤害感受器的MOR不减轻全身吗啡的抗伤害感受

紧接着本研究试图确定促使吗啡镇痛、以及启动耐受和OIH的特定MOR阳性神经元群，由于采用传统的药理学方法难以探到突触前后MOR的特殊功能，利用小鼠基因工程技术，产生缺失MORs的TRPV1神经元谱系的条件性基因敲除小鼠（MOR cKO小鼠）。携带外显子2和3的Oprm1等位基因loxP与表达受Trpv1基因启动子驱动的Cre重组酶敲入小鼠进行交配。 在成年小鼠，TRPV1很大程度上限定于肽能伤害感受器，但也在非肽能和发育早期的有髓伤害感受器表达，导致绝大多数伤害性感受器的Cre介导重组。从而MOR cKO小鼠DRG的Oprm1基因选择性切除，脊髓或脑中的保持完整。荧光ISH和IHC实验显示MOR cKO小鼠Oprm1仅在6.3% (ISH)和4.2% (IHC)的背根神经元表达,在同窝对照组中表达为42.6% (ISH)和38.7%(IHC)。在脊髓背角CGRP 阳性的I层和II层外部，MOR免疫反应明显降低，而在IB4阳性的II层有微弱MOR信号表达，并表达于脊髓中间神经元。

临床上，阿片类药物对感觉和痛苦体验的情感维度都有缓解作用。接下来评估基础伤害性感受和MOR cKO鼠的吗啡抗伤害感受，监测伤害性感觉反射和情感动机行为。条件性MOR敲除鼠呈现出与同窝对照组相似的，对热和机械刺激的基础伤害性反射和情感动机反应。值得注意的是，虽然对照组小鼠急性鞘内注射吗啡 (1 μg) 产生了强烈的抗伤害感受，但在条件性MOR敲除鼠，吗啡鞘内注射没有产生明显的反应或情感动机的抗伤害感受，表明这种脊髓阿片样物质的抗伤害作用主要来源于伤害感受器中的突触前MOR信号传导。相比之下，条件性MOR敲除鼠皮下注射吗啡 (10 mg/kg) 产生最大反应和情感动机的抗伤害效应。

4.吗啡作用于伤害感受器的MORs预示吗啡耐受和OIH的启动

本研究评估了条件性MOR敲除小鼠中吗啡镇痛耐受性和OIH的发展。作者用全身固定剂量的吗啡（10 mg/kg，皮下注射）每日一次，持续10天处理小鼠。在每日注射前和注射后30分钟测量热和机械伤害阈值，以及对有害热刺激的情绪动机反应来分别评估OIH和耐受性。值得注意的是，发现虽然吗啡在同窝对照组中抗伤害感受效应逐渐减弱，而在MOR cKO小鼠，吗啡全天保持接近完全镇痛效果。此外，MOR cKO小鼠对热和机械刺激产生较对照小鼠明显少的OIH。这一结果提示长期阿片类药物的作用于伤害感受器表达的MORs，触发了促伤害感受适应不良的可塑性起始，导致镇痛耐受性和OIH。

5.阿片类物质诱导MOR依赖的脊髓突触前形式的LTP

阿片类药物不仅可以急性抑制脊髓的突触传递，还会引发兴奋性可塑性机制，例如LTP。 是否激活突触前或突触后膜MOR的信号机制触发阿片类物质诱导的LTP尚不清楚。为回答此问题，作者采用在TRPV1伤害感受器表达光激活通道视紫红质2 (ChR2) 的条件性MOR敲除鼠及同窝对照鼠，来检测伤害感受器和脊髓神经元之间的突触传递。作者证实了DRG伤害感受器胞体及中枢突在脊髓I层和II层外ChR2-eYFP的表达。并作了此神经元与单突触的全细胞记录。用MOR激动剂-脑啡肽 (DAMGO) 作用在所记录的神经元5分钟后,光诱发的兴奋性突触后电流 (EPSCs) 出现快速抑制（在施用5分钟时抑制52%±10.5%）。30分钟后冲洗DAMGO，EPSC振幅增强至142.2%±6.1%，这与以前的报告一致。这种阿片诱导LTP在记录期间持续存在。值得注意的是，发现在MOR cKO小鼠，所记录的9个神经元中DAMGO诱导的抑制和LTP有9个完全丢失 （对照的98%±8.12%DAMGO冲洗：96.2%±11.9%）。总的来说，该结果确定了TRPV1伤害性感受器突触前MOR信号对于阿片类药物诱导的LTP脊髓适应不良的是至关重要的。

6.外周MOR阻断可预防吗啡耐受和OIH的发生

条件性敲除Oprm1证实在DRG伤害感受器中MOR信号的丧失可预防吗啡镇痛耐受和OIH发生。作者推断外周MOR药理性阻断可同样缓解此类阿片类药物的副作用。在野生型C57Bl/6J小鼠中，作者用甲基纳曲酮溴化物 (MNB)——一种不透过血脑屏障MOR拮抗剂皮下注射，发现吗啡用药极大减少伤害性反射，并有效缓解情感动机行为。作者用MNB (0.1～10.0 mg/kg) 的联合处理没有改变吗啡抗伤害作用，接下来用固定吗啡 (10 mg/kg) 和MNB (0.1～10.0 mg/kg) 的组合，或吗啡，每天一次，持续7天来处理小鼠，确定MNB是否能够有效阻止阿片类镇痛耐受和OIH。作者发现，吗啡加MNB共同治疗，小鼠耐受和OIH发生呈剂量依赖性下降。MNB联合治疗的用药不产生任何测试剂量的身体戒断行为

7.MNB和吗啡联合治疗长效缓解慢性疼痛

临床上阿片类药物是用于管理围术期的和慢性的疼痛。作者接下来评估了持续性疼痛时吗啡和MNB联合治疗的镇痛效果。作者使用了胫骨骨折和骨钉扎模型的骨创伤炎性疼痛，发现虽然单独用吗啡 (10 mg/kg)很快产生抗伤害感受，长时间治疗7 d后的吗啡不再有效地减少原躯干痛伤害性刺激或情感动机。相比之下，吗啡 (10 mg/kg) 和MNB(10 mg/kg) 的联合疗法产生强烈的抗机械伤害性感受超敏反应，以及情感动机疼痛反应，并不出现耐受。此外，在长期联合治疗期间没有观察到OIH。同样，在神经病理性CCI模型中吗啡和MNB联合治疗也阻止了镇痛耐受的发展。总之，该研究的药理作用结果揭示了阿片类外周拮抗剂具有限制长期阿片类使用所致的促伤害感受的副作用的潜在价值。

讨 论

本文研究确定了阿片信号作为关键的分子，通过初级传入伤害感受器的MORs，而不是脊髓小胶质细胞，触发伤害性神经环路中适应不良可塑性改变，从而导致镇痛耐受和OIH。在长期阿片类药物治疗之后，MOR的几种细胞类型和回路被发生改变，包括在DRG的水平伤害感受器、脊髓神经元、脊髓小胶质细胞、脑干核团、皮质下和皮质脑区。作者提出吗啡诱导的表达MOR的伤害感受器敏化，可易化CNS疼痛和镇痛环路的下游可塑性变化，促进OIH和吗啡耐受。因此，消除外周MOR信号可使阿片类药物中枢镇痛作用保留。

非选择性药理性胶质细胞抑制剂，如米诺环素和propentofylline，是所熟知的可减轻啮齿动物的阿片耐受，最近有提出吗啡作用于表达在小胶质细胞上的MORs，激活这些细胞并启动OIH。与以前从体外和体内研究的调查结果相反，本研究用多种组织学方法和高度敏感的、非培养急性纯化的成年脊髓小胶质细胞的RNA阵列，并没有发现支持MOR在小胶质细胞表达的可信的证据。很显然，在培养条件下的神经胶质细胞可展示出改变的表型，从而与它们在体内基因表达的类型不一致，包括受体的异位表达。值得注意的是，与本研究的发现一致，在神经元和神经胶质细胞的大规模RNA测序研究以及ISH实验，提示小胶质细胞不表达MORs。作者也发现MOR KO小鼠显示完整的吗啡诱导的小神经胶质细胞激活，但不表达OIH，表明在OIH和小胶质细胞的组织学指征无关。该分子机制暗示，在长期吗啡处理小胶质细胞激活期间，必须通过受体而不是MOR介导发生。小胶质细胞激活的几种途径强调触发小神经胶质细胞增生过程的复杂性，强调了从神经元释放分子的可能性，除了吗啡对小胶质细胞的直接作用之外，可能与以下所观察到的吗啡处理的激活反应有关。例如，识别小胶质细胞上的TLR4受体可能通过神经元释放的结合损伤相关的分子类型(DAMPs)或通过结合吗啡本身引发激活，但最后一点仍依然存在争议。最近的研究提出TLR4对吗啡或阿片耐受和痛觉过敏的所致的小胶质细胞活化不是必须的。其它提出控制小胶质细胞活化状态的关键调质包括TLR2，小胶质细胞ATP受体P2X4和CSF1R。因此，作者提出阿片样作用表达是通过伤害性感受器上的MORs，而不是小胶质细胞，触发疼痛通路中的下游事件发生，这些反而促进分子，突触和网络水平的适应，导致耐受和OIH，以及小胶质细胞激活和LTP。

阿片诱导的脊髓伤害性感受器的LTP现被认为是OIH的基本促进因素，也可能促使吗啡耐受。然而，阿片类药物诱导的脊髓LTP机制仍然存在争议，特别是突触前与突触后的启动过程。目前，在TRPV1伤害感受器和背角神经元间的光遗传讯号的突触传递揭示，消除突触前MOR不仅消除DAMGO诱导的神经传递抑制，也消除了LTP，支持突触前起源假说。因此本文提出，长期阿片类药物暴露时，伤害感受器中MOR长时间激活，具有重要的促伤害感受作用，并且通过中枢神经系统整个伤害性感受通路来驱动耐受和OHI发展，进而启动下游可塑性变化。此时并不能确切得出伤害性感受器中促进吗啡耐受和OIH发生的MOR的细胞定（如在伤害感受器皮肤外周神经末梢、伤害感受器轴索或伤害感受器细胞体）。但值得指出的是，反复皮内给予MOR激动剂，可以说只作用于伤害性感受器外周末端的MOR，或外周作用的阿片类药物洛哌丁胺慢性给药足以诱导OIH和镇痛耐受。

虽然阿片类药物仍然广泛用于围手术期、癌痛和慢性非癌症疼痛的治疗，近期重新评估阿片类药物的副作用，强调剂量增加是致死性和并发症增多的直接因素。风险减缓策略可潜在减少吗啡耐受和OIH，限制剂量升级，是目前阿片流行病的迫切需要。根据作者条件性MOR敲除鼠和MNB对未损伤的小鼠、围术期和慢性疼痛的的研究结果，作者提出，通过阻断伤害性感受器的MOR可改善人类的吗啡耐受。外周限制性的阿片拮抗剂，如MNB和口服纳络酮，是临床用于治疗非癌痛病人阿片诱导的便秘，临床试验没有发现这些药物给药后疼痛或戒断症状增加或仅轻微增加。迄今为止，没有临床研究直接评估外周性MOR拮抗剂减少阿片类镇痛药耐受性的效果。不过，最近的三期临床试验报告，MNB对阿片类药物引起的便秘发现，与安慰剂相比，服用MNB (12 mg，隔日1次) 1～4周后可稳定或减少吗啡使用，视觉模拟评分量表(visual analogue scale, VAS)评分没有增加。此外，口服缓释羟考酮联合纳洛酮对慢性疼痛病人的疼痛缓解与便秘观察发现，与治疗单独使用羟考酮相比，前者对疼痛的缓解更为显著，可明显减低疼痛评分。鉴于阿片拮抗剂纳洛酮具有非常低的口服生物利用度和极大的首过代谢效应，在此情况下，该结果提示纳络酮是通过阻止外周阿片受体起作用。相反，一项临床研究报告表明MNB治疗增加病人在手术后的第一个4小时吗啡消耗量，但之后无此作用。特别高剂量的MNB (0.9 mg/kg) 使用，即比目前推荐治疗剂量高6倍的量，且比之前的剂量高两倍，显示有中枢神经系统的作用，可能导致中枢神经系统的阻断，因此MNB的外周限制性被认为是剂量依赖性的。与这种可能性一致，接受高剂量MNB而不是安慰剂的病人，表现出较高的恶心和呕吐发生率，提示阻断中枢MOR后的撤药综合征，可以解释吗啡消耗量的增加。值得注意的是，这一发现以及使用外周MOR拮抗剂的临床前研究提示，MOR外周信号促使在受伤后数小时内发生内源性镇痛。而中枢MOR信号介导更长的时间的从伤后几天到几个月内源性镇痛。的确，本研究没有发现MNB增加骨创伤或神经损伤相关的疼痛，表明内源性镇痛机制不受这种治疗的影响。

本研究得出结论，表达在初级传入伤害性感受器的MORs，驱使对阿片类药物的不利反应促进镇痛耐受和OIH的发生。本研究的数据支持，在限制潜在有害的阿片类药物剂量递增时，阻断外周MOR信号来维持完全长时间疼痛控制的治疗策略。人类试验的设计旨在严格评估阿片激动剂/外周阿片拮抗剂联合用于有恰当阿片类药物反应的疼痛病人的潜在转化价值，将对于开发更安全，更有效的疼痛管理策略至关重要。