鄂梨2号叶片高效再生体系的建立

涂俊凡+秦仲麒+李先明+伍涛+杨夫臣+朱红艳+刘政+杨立

摘要：以早熟砂梨品种鄂梨2号组培苗叶片为外植体，建立叶片再生体系。结果表明，鄂梨2号叶片再生不定芽最佳培养基为NN69+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L IBA，愈伤组织再生率达到100%，不定芽再生率为36.67%；不定芽增殖最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，增殖系数为2.19；不定芽在1 000 mg/L ABT中浸蘸5 s后接种在添加500 mg/L活性炭的1/2MS培养基上，生根率最高，为66.67%；试管苗移栽成活率为84.44%。

关键词：砂梨；鄂梨2号；组培苗叶片；再生

中图分类号：S661.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）23-4613-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.049

Abstract： Leaves excised from Eli 2 Hao were used as explants to establish regeneration system. The results indicated that the maximum adventitious buds regeneration frequency achieved 36.67% on the mediu of NN69+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L IBA. The most suitable medium for shoot multiplication was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA and the average multiplication coefficient was 2.19. The buds were dipped in 1 000 mg/L ABT for 5 s and inoculated on 1/2MS medium with 500 mg/L activated carbon. The highest rooting rate was 66.67%， and the survival rate of plantlets was 84.44%.

Key words： sand pear； Eli 2 Hao； leaf； regeneration

鄂梨2号是湖北省农业科学院果树茶叶研究所选育的优质早熟砂梨新品种，果实7月中下旬成熟。果皮黄绿色，果实倒卵圆形，平均单果质量200 g，含可溶性固形物12.0%～14.7%，总酸0.14%～0.16%[1]。本研究以早熟砂梨品种鄂梨2号试管苗叶片为试材，进行不定芽诱导与增殖以及生根等培养基的筛选，建立叶片高效再生体系，为鄂梨2号梨的规模化繁殖、遗传转化改良及无性系变异筛选奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为早熟砂梨品种鄂梨2号[Pyrus pyrifolia Nakai.cv.Eli 2 No.2]，组培苗来自湖北省农业科学院果树茶叶研究所实验室，叶龄30 d左右，外植体为长势良好的叶片。

1.2 叶片不定芽诱导

取继代培养4～5周、长势较为一致的试管苗上部叶片，在无菌条件下，将叶片切割成大小为0.5～1.0 cm×0.5～1.0 cm的叶盘，每个处理接种20个外植体，重复3次，接种在附加TDZ和IBA的NN69、MS培养基上，30 g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂、pH 5.8。暗培养3周后转至光下培养。培养温度（25±2） ℃，光照1 500 lx，光周期16 h/d。接种后60 d统计数据。不定芽诱导率=萌芽外植体数/接种外植体数×100%。

1.3 不定芽的增殖

将叶片上诱导的不定芽接种在不同处理的MS增殖培养基上。①细胞分裂素对鄂梨2号组培苗增殖的影响：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 6-BA共5个浓度梯度。②生长素对鄂梨2号组培苗增殖的影响：0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L NAA；0.05、0.10、0.20 mg/L IBA。20 d后统计不定芽。

1.4 组培苗生根与移栽

组培苗生根：切取长约2 cm生长健壮的不定芽，在不同培养基上生根培养。浸蘸生根法：组培苗基部在1 000 mg/L ABT溶液中浸泡5 s后，接种在不同培养基中。每处理30个外植体，重复3次，暗培养2周，30 d后统计生根率。

组培苗移栽：用23 cm×18 cm的营养钵做移栽容器，将根长0.5 cm以上的试管苗放在温室中炼苗，加遮阳网闭瓶炼苗7 d，开瓶炼苗1 d后，洗净根系，移栽入不同基质的营养钵中。塑料拱棚保湿，上盖遮阳网。每天适量浇水，30 d后统计移栽成活率。

2 结果与分析

2.1 培养基对鄂梨2号叶片不定芽再生的影响

由表1可知，基本培养基的种类及激素浓度对鄂梨2号不定芽再生有显著影响。处理A6不定芽分化率最高（36.67%），不定芽数量较多，茎、叶明显，长势好；处理A8出芽率次之，不定芽数量较多，长势较好。鄂梨2号叶片接种后，暗培养7 d左右，叶片開始膨大（切口和叶脉处明显膨大）；21 d左右出现芽点；30 d后，芽点发育成明显小芽。鄂梨2号叶片接种在NN69+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L IBA培养基上，21 d暗培养后，转入光照培养，愈伤组织再生率100%，不定芽再生率36.67%。

2.2 不定芽增殖

2.2.1 细胞分裂素对鄂梨2号组培苗增殖的影响 鄂梨2号叶片不定芽接种在添加0.1 mg/L IBA和不同浓度6-BA的MS培养基上。结果表明，6-BA浓度为0.5～1.5 mg/L时，不定芽正常增殖，且随着浓度增加，组培苗增殖系数增加。6-BA浓度大于2.0 mg/L时，组培苗易玻璃化（表2）。endprint

2.2.2 生长素对鄂梨2号组培苗增殖的影响 鄂梨2号叶片不定芽接种在添加1.0 mg/L 6-BA和不同浓度的NAA和IBA的MS培养基上。结果表明，添加不同浓度的NAA和IBA对鄂梨2号组培苗生长势有较大影响。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.02～0.05 mg/L NAA，继代的组培苗生长健壮，叶片淡绿，NAA浓度高于0.1 mg/L时，组培苗基部生成较多愈伤组织。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.10～0.20 mg/L IBA，继代的组培苗生长健壮，IBA浓度低，继代的组培苗生长缓慢，浓度为0.30 mg/L时，组培苗细弱（表3）。

2.3 不同生根剂及处理方法对组培苗生根的影响

鄂梨2号组培苗在高浓度的生根剂中浸蘸的生根效果优于添加低浓度生根剂的培养基。鄂梨2号组培苗在1 000 mg/L ABT中浸蘸5 s后接种在添加500 mg/L活性炭的1/2MS培养基上，生根率最高，为66.67%。组培苗在添加不同浓度生根剂的培养基上，生根率仅为8.33%～16.67%（表4）。

2.4 组培苗移栽

移栽基質对组培苗移栽成活率有重要的影响。不同移栽基质组培苗成活率差异很大，蛭石和珍珠岩（体积比2∶1）作为移栽基质时成活率最高，为84.44%；蛭石和珍珠岩（体积比1∶1）作为移栽基质效果次之，为61.11%，蛭石作为移栽基质的生根率为45.56%；蛭石和草炭配比的基质效果最差，为22.22%（表5），生根组培苗移栽第一周部分已腐烂。图1为鄂梨2号叶片组织培养再生。

3 结论与讨论

植物组织培养中，基础培养基种类包括MS、1/2MS、NN69、WPM等[2-10]，大量研究结果证明NN69比较适宜梨品种叶片再生[2-4]，与本试验结果一致。以NN69为基本培养基，添加TDZ和IBA两种生长调节剂，建立了鄂梨2号叶片离体直接再生体系，使鄂梨2号的组培苗工厂化生产成为可能。

细胞分裂素（6-BA等）与生长素（IBA等）配合使用，比例协调时可促进芽苗增殖及伸长生长[2，5]。本试验在不定芽继代增殖过程中，配比使用6-BA、NAA或IBA，促进了不定芽的增殖和伸长生长，组培苗增殖系数偏低，长势较好。组培苗增殖过程中，繁殖系数过高，会引起组培苗弱化，生长势变差。一般可通过降低细胞分裂素浓度降低高代次繁殖系数，而维持较高的平均繁殖系数和较好的试管苗长势，有关问题需进一步研究。

本试验通过组培苗在高浓度的生根剂中浸蘸后接种在不含植物生长调节剂的培养基上，生根率达到66.67%，且生根时间较短。根原基的启动和形成阶段生长素起关键作用，而根原基的伸长和生长则可以在没有外源生长素的条件下实现。生长素可能主要在根的诱导和发端起作用，但根原基形成后，较高浓度的生长素的继续存在则不利于幼根的生长发育。本试验成功建立了鄂梨2号叶片不定芽分化和植株再生体系，为鄂梨2号的遗传转化和基因工程育种打下了基础。

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