提高小麦叶枯菌筛选敏感度的方法

张志刚+王开梅+杨自文+万中义+张遵霞

摘要：为了提高先导化合物杀菌活性筛选敏感度，选用小麦叶枯菌（Mycosphaerella graminicola）作为供试靶标，比较了半固体法杀菌活性筛选中的不同单孢子纯培养对标准样品杀菌活性的敏感度。结果表明，小麦叶枯菌不同单孢子纯培养，对标准样品的敏感度差异显著。基于以上结果，使用微生物源发酵提取物对敏感的单孢子纯培养和对照培养物进行了验证筛选。结果表明，对1 920个样品的筛选中，敏感的单孢子纯培养比对照培养物的活性样品检出率提高2.24%，活性样品检出数量增加54.43%。

关键词：小麦叶枯菌（Mycosphaerella graminicola）；先导化合物；筛选敏感度；半固体法；单孢子

中图分类号：S482.2；S435.121.4+8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）23-4510-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.022

Abstract： To improve sensitivity for fungicidal activity screening of lead compounds，Mycosphaerella graminicola was selected as test target to compare the sensitivity of different pure cultures from single spore to fungicidal activity of standard samples in semisolid fungicide screening. The results showed that sensitivity was significant different between different pure cultures. Based on above results， the sensitive pure culture and the reference culture were verified and screened with microbial fermentation extracts， it was concluded that in screening of 1 920 samples， the hits rate of sensitive pure culture rose by 2.24% and the number of hits increased 54.43% comparing with the reference culture.

Key words： Mycosphaerella graminicola； lead compound； sensitivity of screening； semisolid screening； single spore

在杀菌剂的先导化合物筛选中，样品的杀菌活性强度是化合物和供试靶标菌在特定环境条件下的协同表现，因此，它不仅与化合物自身的杀菌特性有关，同时也受供试靶标菌的敏感性、测试培养时间、培养温度以及化合物在培养过程中的降解等因素的影响。在微生物源先导化合物高通量筛选体系中，筛选敏感性的提高就等同于提高了整个筛选流程的筛选效率，提高样品的利用率，也减少了新化合物的漏筛。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 小麦叶枯菌（Mycosphaerella graminicola） 本試验中使用的小麦叶枯菌，是以ATCC 62714为原始菌株，菌种保存温度为-70 ℃，经过弹土法活化，再进行单孢子分离纯化。

1.1.2 杀菌剂标准样品 嘧菌酯（Azoxystrobin 95%）、咪鲜胺（Prochloraz 98%）。

1.1.3 试剂 无水乙醇，PDA、PDB培养基，琼脂粉，以上试剂均为市售生化试剂。

1.1.4 微生物源提取物 由湖北省生物农药工程研究中心微生物资源研究室提供。

1.1.5 主要仪器、设备 血球计数板、光学显微镜、高压灭菌锅、超声波振荡器、电子移液器（MCE8k）、Intega 96通道移液机、96孔组织培养板（深孔）、96孔组织培养板（浅孔）、人工气候箱（光、温可调）、超净工作台。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦叶枯菌单孢子纯培养制备[1] 原始菌株冻干粉（ATCC 62714）以弹土法在PDA培养基上进行单菌落分离培养，培养2周后，选取分界清晰的菌落7个，进行扩大培养，培养3周备用。小麦叶枯菌（Mycosphaerella graminicola）孢子悬浮液制备：取上述7个培养物（直径9 cm培养皿），分别在培养皿中加入10 mL无菌水，洗下孢子，制成孢子母液。以灭菌的医用纱布过滤掉菌丝，用无菌水稀释，制成孢子悬浮液。每毫升孢子悬浮液含孢子20～30个。移取1 mL孢子悬浮液，均匀涂布在PDA培养基表面。每个培养物使用4个分离培养皿。培养2周后，从每组纯培养中选取菌落分布均匀的培养皿，每组选择3个分界清晰的菌落编号。把选出的单孢子菌落接种于斜面培养基，制成菌种，编号保存。同时，各单孢子菌落接种于PDB液体培养基，在250 mL三角烧瓶中进行摇瓶培养。培养2周后，移取1 mL摇瓶发酵液作为菌种，涂布在培养皿培养基表面，继续培养2周后，即获得单孢子纯培养。21个单孢子均重复制备5份，备用。

1.2.2 小麦叶枯菌对照培养物准备 直接取少量原始菌株冻干粉，接种于PDB液体培养基，在250 mL三角烧瓶中进行摇瓶发酵活化。培养2周后，移取 1 mL摇瓶发酵液作为种子，涂布在培养皿培养基表面，进行扩大培养。培养2周后，作为对照培养物。重复制备对照培养物5份。

1.2.3 小麦叶枯菌单孢子纯培养及对照培养物对标准样品的敏感性试验[2]

1）感染培养基的制备：以标准PDB培养基为基础，加入0.7%琼脂，配制成半固体感染培养基。分别在各纯培养的培养皿中加入10 mL无菌水，洗下孢子，过滤，制成孢子悬浮液，计数后备用。根据孢子悬浮液的孢子浓度，以培养基（接种温度55 ℃左右）进行稀释，备用。孢子在感染培养基中的浓度为104个/mL。

2）把两个标准品配制成母液，浓度为0.2 mg/mL，以无菌水稀释成12个不同的浓度梯度。把样品稀释液加入96孔组织培养板（浅孔）中，加入量为0.01 mL/孔。每个浓度设2个重复。重复试验3次。

3）把上述1）中的感染培养基分装到2）的96孔组织培养板中，每孔加入0.09 mL[3]。以上述相同方法处理对照培养物，作为单孢子纯培养的参照。培养温度25 ℃，相对湿度70%～80%，遮光培养。4 d后检查并记录结果。根据活性反应的不同，使用分级指标数（0、3、5、7、9）标记杀菌活性[4]，计算LC50。

4）小麦叶枯菌的单孢子纯培养及对照培养物对微生物源提取物的筛选试验[5]随机选择提取物样品480个，把提取物配制成母液，浓度为4 mg/mL，以无菌水稀释到0.8 mg/mL。预先把提取物样品稀释液加入96孔组织培养板（浅孔）中，加入量为0.01 mL/孔。根据“1.2.3”的试验结果，选择最敏感的单孢子纯培养制备感染培养基，向已加入了提取物样品稀释液的组织培养板中注入感染培养基，感染培养基加入量0.09 mL/孔。至此，提取物终浓度为0.08 mg/mL，感染培养基孢子终浓度为9×103个/mL。每个样品只用1个浓度进行筛选，每个浓度设2个重复。以上述相同方法处理对照培养物，作为单孢子纯培养的筛选敏感性试验的参照。培养条件为：培养温度25 ℃，相对湿度70%～80%，遮光培养。根据活性反应的不同，使用分级指标数（0、3、5、7、9）标记杀菌活性。4 d后检查并记录结果。分4周完成四批样品的对比筛选，每批样品均为480个，筛选样品总量为1 920个。

2 结果与分析

2.1 小麦叶枯菌不同单孢子纯培养对标准样品的敏感性试验结果

以弹土法分离出的7个菌落，编号为A、B、C、D、E、F、G。进一步对7个培养物进行重复分离纯化，每个培养物中分选出3个单孢子，编号为1、2、3。扩大培养，获得单孢子纯培养21个。测定21个单孢子纯培养及对照培养物对两个标准样品的敏感性。由表1可知， C组单孢子纯培养对嘧菌酯最敏感，LC50平均值为0.336 μg/mL，G组单孢子纯培养对嘧菌酯最不敏感，LC50平均值为2.712 μg/mL，后者为前者的8.079倍； C组单孢子纯培养对咪鲜胺最敏感，LC50平均值为0.016 μg/mL，G组单孢子纯培养对咪鲜胺最不敏感，LC50平均值为0.065 μg/mL，后者为前者的4.083倍。

2.2 小麦叶枯敏感菌株与对照菌株对微生物源提取物的对比筛选结果

根据“2.1”的试验结果，选择C-3号菌株进行扩大培养，按照“1.2.3”的方法1）制备单孢子纯培养和对照菌株的感染培养基。为了简化数据处理，筛选结果无论活性强弱，均都统计为有活性。由表2可知，单孢子纯培养组的活性样品检出率提高了2.24%，活性样品检出数量增加了54.43%。可见单孢子纯培养提高了筛选的敏感度。

3 小结与讨论

杀菌剂先导化合物筛选的目标是具有杀菌活性的新化合物，这些新化合物的活性通常较弱，活性和结构也不稳定。为了提高新药筛选的效率，一方面通过优化筛选方法，使用快速、微型化的生物测定方法来提高筛选的灵敏度和筛选通量；另一方面是选择敏感的筛选靶标提高筛选敏感度。使用合适的敏感菌株，可以让新药筛选事半功倍。通常从田间分离或者经过长期保藏的菌株，由于菌株分离的地域、气候、环境等差异，菌株敏感性差异较大，并不适用于新药筛选。小麦叶枯菌是Dothideales科的模式真菌，其孢子产量大，非常适合高通量筛选，但国内还没有找到适用的敏感菌株。本次对ACTT 62714菌株冻干样品进行的单孢子分离纯化，获得的不同单孢子纯培养对标准样品的敏感性差异较大。在对敏感菌株进行的验证筛选中，检出的活性样品量比对照菌株也有显著提高。对于大多数病原真菌，以单孢子分离纯化的方法来筛选更敏感的供试菌，敏感度提升的空间不太大。但这种方法的优点在于，既提高了筛选的敏感度，又保证了供试菌品系的延续性。小麦壳针孢叶枯病在中国多为无性世代，在新西兰、澳大利亚、英国等国家多为有性世代，品系间差异性大，要找到一个合适的敏感菌株，还需要收集更多的菌株样本进行筛选和驯化。

参考文献：

[1] 于淑晶，边 强，王满意，等.高通量筛选技术在农用杀菌剂创制研究中的应用[J].农药，2012，51（8）：550-553.

[2] 郭建荣，国娇娇，马新颖，等.小麦壳针孢叶枯菌侵染与致病机理研究进展[J].中国农学通报，2014，30（6）：20-25.

[3] 冯俊涛，石勇强，张 兴.56种植物抑菌活性筛选试验[J].西北农业科技大学学报（自然科学版），2001，29（2）：65-68.

[4] 张志刚，杨自文，王开梅，等.微生物源杀菌剂先导化合物筛选研究[J].湖北农业科学，2015，54（23）：5896-5899.

[5] 邱立紅，张文吉，王成菊，等.高通量筛选在新农药创制研究中的应用[J].农药科学与管理，2002，23（5）：20-24.