黄继红 ,纪小国 ,田 青 ,惠 明 *,卞 科 ,林江涛
(1.河南工业大学 生物工程学院,河南 郑州 450001;2.河南省食品工业科学研究所有限公司,河南 郑州 450001;3.河南工业大学 粮油食品学院,河南 郑州 450001)
基于蛋白质组学技术的麦胚蛋白研究进展
黄继红1,2,纪小国1,田 青1,惠 明1*,卞 科3,林江涛3
(1.河南工业大学 生物工程学院,河南 郑州 450001;2.河南省食品工业科学研究所有限公司,河南 郑州 450001;3.河南工业大学 粮油食品学院,河南 郑州 450001)
对麦胚蛋白质的分类、蛋白质组学信息及功能等方面进行了综述,展望了麦胚蛋白质组学的应用领域与面临的挑战,为其在医药、保健品等领域的开发利用提供了新思路。
麦胚蛋白;蛋白质组学;功能
小麦胚是小麦籽粒的生命源泉[1],含有极其丰富且优质的蛋白质、脂肪、多种维生素、矿物质及微量生理活性成分,被誉为“人类天然的营养宝库”,素有“生命之源”的美称[2-3]。研究表明,麦胚中蛋白质含量在30%左右,主要以清蛋白和球蛋白为主。近年来,对麦胚球蛋白的研究越来越受到重视,其组成成分、功能、理化性质及分离技术等方面的研究亦愈发深入,使其在小麦精深加工行业中备受青睐[4-5]。麦胚蛋白质资源的开发利用对于提高国内小麦加工附加值,缓解十分紧缺的蛋白资源,提高人类膳食营养与健康水平具有重要的现实意义。蛋白质组学技术作为利用大数据和生物信息学技术揭示蛋白质分子功能及生理调节机制的研究方法广泛应用在功能食品、保健品开发、功能验证上来,大量的麦胚蛋白质组学的研究数据集成到麦胚蛋白领域。麦胚蛋白质组学是在整体水平上研究麦胚蛋白特性,包括蛋白质的表达、分类、功能分析以及蛋白质间的相互作用。在麦胚生理、发育及后续加工发生的过程中,蛋白质组学技术可以作为揭示其分子功能及细胞调节机制的研究方法。本文就麦胚球蛋白组分肽质量指纹谱及氨基酸序列谱等方面的蛋白质组学信息及功能进行综述,便于人们对麦胚更深层次的认知,并为其在医药、保健品等领域的开发利用提供思路。
高效的分离提取技术是开展麦胚球蛋白各种相关研究的重要前提之一。对植物来源球蛋白的提取一般采用传统的Osborne分级分离-透析工艺、盐溶酸沉工艺和醇洗工艺。Wu等[4]按照Osborne分级分离的方法获得麦胚球蛋白,其得率为5.8%,纯度可达87.3%;张春红等[6]以麦胚为原料,经脱脂、碱提,然后采用Osborne分级分离-透析法对所得蛋白进行分级分离,得到麦清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,其中球蛋白占总蛋白15.6%。但不同提取方法使提取的蛋白的种类有很大差别。
Mak等[7]用二维凝胶电泳鉴定和表征小麦胚芽中的蛋白质组成,该提取物在两个不同的pH梯度:pH值 4.0~7.0和 6.0~9.0进行电泳分离,将612个蛋白质斑点从凝胶切除并进行肽质量指纹图谱分析,确定了347个蛋白质的序列,根据功能分为301种不同类型的蛋白质。剩余的265个蛋白质斑点是未表征蛋白。Skylas等[8]在麦胚蛋白质组中鉴定出6种不同类型的酶类,包括氧化还原酶、转移酶和水解酶等。鉴定的蛋白质接近2/3(66%,175个点)参与激活胚的生长和发育过程相关的功能,例如转录、翻译、能量和一般代谢、转运、细胞分裂和信号进程(见图1)。
图1 麦胚功能蛋白质组成Fig.1 The compositions of function protein of wheat germ
刘向标等[9]对“晋麦-47”小麦种子未萌发和萌发3 h、16 h和 25 h的麦胚进行了研究,利用2-DE凝胶识别的蛋白点分别有 127、131、135和141个,其中表达量变化2.5倍以上的蛋白点有17个,初步鉴定出4个蛋白质分别是核苷二磷酸激酶Ⅰ、17.5 kDa热休克蛋白、ATP结合酶和LEA蛋白27。李鲜花等[10]分析了干旱胁迫下野生小麦根中的蛋白质变化。结果共分离鉴定得到85个表达差异倍数在1.5以上的蛋白质。这些差异蛋白主要涉及碳代谢(27%)、氨基酸代谢(15%)、解毒与防御(11%)、分子伴侣(8%)、能量代谢(8%)、信号传导(6%)、蛋白质代谢(5%)、脂代谢(5%)、转录与翻译(4%)、核苷酸代谢(2%)以及骨架蛋白(1%)。王凯等[11]采用高效液相色谱分离脱脂小麦胚芽提取液中的蛋白质,用质谱对其进行识别,研究了提取过程中不同蛋白质的释放速率和释放率,为进一步优化小麦胚芽蛋白的提取工艺提供技术基础。用色谱对脱脂小麦胚芽中的蛋白质进行分离,经酶解后从中识别出30余种蛋白质,表1列出了其中丰度较高的17种蛋白质。
表1 麦胚球蛋白组分LC-MS分析识别结果[11]Table 1 The proteins identified from defatted wheat germ using HPLC-MS
杨铭乾[12]利用食盐溶液提取的麦胚球蛋白,通过红外光谱鉴定小麦胚芽球蛋白聚合体的二级结构组成主要为无规则卷曲(30.95%),其次为β-折叠 (27.02%) 和 α-螺旋 (26.55%),β-转角(15.48%)所占比例最小。通过LC-MS/MS分析,得到392个蛋白质组,包括1 274个蛋白。经Uniprot数据库查询比对可知,样品主要由球蛋白家族(WHEAT Globulin-3、Globulin-3A、Globulin-3B、Globulin-3C)、热休克蛋白(HSPs)、组蛋白、非特异性脂质转移蛋白、晚期胚胎富集蛋白、防御素等组成。由于这些蛋白的存在,不仅使小麦在生长发育过程中能够预防病害、抵抗逆境和维持正常代谢等,同时也具备较高的药用价值,在防治心血管疾病、肿瘤和提高免疫力方面效用较高。而在增强免疫方面则以热休克蛋白表现最为突出[13-15]。
Ji等[16]基于LC/MS对麦胚球蛋白组分鉴定、代谢通路分析,经GO功能注释和KEGG Pathway分析发现麦胚球蛋白共涉及分子功能31种、细胞组成47种和生物过程调控87种,参与到代谢通路调控104条。蛋白质互作网络(PPI)分析,共包含具有统计学特征的蛋白质互作子网络5个,枢纽蛋白23个。对鉴定所得的蛋白质进行KEGG Pathway分析,发现麦胚球蛋白参与到了104条通路,如图2所示,系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus)相关蛋白 12%,酒精中毒(Alcoholism)相关蛋白12%,核糖体(Ribosome)相关蛋白10% ,剪接体(Spliceosome) 相关蛋白 7%,RNA转运(RNA transport)相关蛋白4%,蛋白质在内质网形成过程蛋白(Protein processing in endoplasmic reticulum)4%,碳代谢(Carbon metabolism)4%,在真核生物核糖体生物起源(Ribosome biogenesis in eukaryotes)4%,氨基糖和核苷酸糖代谢(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)4%等。
图2 可能参与的通路名称与目标蛋白数目Fig.2 The KEGG Name and Seqs Num in wheat germ protein
黄继红等[17]在麦胚蛋白对系统性红斑性狼疮代谢途径与功能分析中解释了麦胚蛋白主要参与生命活动中重要的3部分(图3)。麦胚蛋白参与分子功能与细胞形成有关,如催化、结构、运输、贮存、运动、防御、调节、信息传递及遗传调控等功能。麦胚蛋白中各种功能蛋白的比例如图4所示。
根据麦胚蛋白质全谱检出结果,通过肽(Peptide)、蛋白质(protein)、KEGG 代谢途径(metabolic pathway)、GO(gene ontology)等数据库分析,得到麦胚功能蛋白参与生物过程,分子功能、细胞功能的分类,与系统性红斑性狼疮的代谢关系,重点剖析了麦胚功能蛋白对系统性红斑狼疮的作用机制,但是对SLE的治疗机理有待进一步系统深入的验证性研究。
图3 麦胚蛋白GO功能注释Fig.3 GO functional annotation of wheat germ protein
图4 麦胚蛋白中各种功能蛋白的比例Fig.4 The proportion of all kinds of functional protein in wheat germ protein
小麦胚芽各种蛋白质中,清蛋白评分最高,具有最高的蛋白质效率比(PER)、体外消化率(IVPD)和较好的氨基酸组成,是一种优质蛋白。刁大鹏等[18]在小麦胚芽清蛋白提取工艺及分子量测定的研究表明,清蛋白分子量分布为分子量分别为10.47、14.45、20.89、26.92、38.02、52.48、85.11kDa。Bahrle[19]指 出 ,麦胚经蛋白质组学分析,水提法麦胚蛋白有球蛋白(Globulin)系列、应激蛋白(HSP70、LEA1 protein、WSI18 protein、Cold regulated protein、Eukaryotic translation initiation factor 4B1、Salt tolerant correlative protein)、抑制肝癌蛋白(5a2 protein)、二聚体泛素(Dimeric ubiquitin)、类甜蛋白(Thaumatin-like protein)、晚胚胎发生丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein)、抗菌蛋白(Wheatwin-1)、转录共激活剂(Multiprotein bridging factor)、脱落酸诱导蛋白(ABA inducible protein)等;淀粉酶(alpha-amylase/subtilisin inhibitor)、 过氧化物酶(Peroxidase)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)、三磷酸异构酶(Triose phosphat-isomerase OS)、二类几丁质酶(Class II chitinase)、 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、 丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin-N3.7)等13种酶类以及未表征蛋白。
国外对麦胚生物活性物质的研究从提取分离技术到分析检测手段都有了长足的进展。Mak等[7]对麦胚功能蛋白质分类和小麦胚乳中的蛋白质组进行比较分析(表2)。表2中有三点是显而易见的,首先,胚芽具有应激相关蛋白作为主要类别的蛋白质(胚芽中21.6%,而这一类蛋白质在胚乳中仅占8.5%);其次,在胚乳中还完全缺少几种功能类别;胚乳中主要存在的存储蛋白(谷蛋白形成麦醇溶蛋白和谷蛋白多肽)在麦胚蛋白中有较小比例(0.9%)。
表2 胚芽与胚乳蛋白质组的功能对比Table 2 Percentage of identified proteins found in different functional classes of the wheat germ promoter compared to the endoscope promoter %
孙震等[20]提取的麦胚盐溶性蛋白(即球蛋白)能明显提高小鼠的脾指数、腹腔巨噬细胞的吞噬比率、吞噬指数和B淋巴细胞的转化功能。William等[21]在麦胚盐提物中分离出了α、γ型蛋白,其中γ型蛋白与免疫球蛋白结构类似。Tai等[22]研究发酵小麦胚芽提取物(FWGE)有抑制卵巢上皮癌(OVCA)复发及抵抗疾病,并从基因水平上探讨其机理;还发现FWGE表现出显著地增强免疫力等功能;又从酵母发酵的麦芽中分离并鉴定出2,6-二甲氧基对苯酮(2,6-DMBQ)和 2-甲氧基对苯醌(2-MBQ),这两种物质具有较强的免疫刺激和抑制癌转移效应,可成功地用作免疫刺激和转移抑制药用组合物中的活性物质,尤其是对肝癌细胞的转移有明显的抑制作用。Atallahi等[23]研究了小麦胚芽提取物对系统性原发性痛经症状的影响严重程度,小麦胚芽提取物不仅减轻痛经而且缓解全身症状(疲劳,头痛和情绪波动),他推测可能是麦胚提取物对痛经及其全身症状的有效治疗,可能是因为其抗炎作用。
周会会等[24-25]研究了小麦胚芽抗肿瘤活性蛋白的分离纯化及抗肿瘤活性,得到了一种高纯度的具有很强的抗肿瘤活性蛋白WGWSP11,对人乳腺癌细胞株MDA-MB231最敏感,并且WGWSP11对正常细胞HEK293的细胞毒性作用较低。Ji等[16]建立了免疫抑制小鼠模型,从基因水平探究麦胚球蛋白的免疫机制,结果表明麦胚球蛋白能明显提高免疫抑制小鼠的胸腺指数、脾脏指数、LDH、T-AOC 和 ACP 活性、CD4+/CD8+、IL-2、IL-4含量,改善Thl/Th2细胞亚群失衡,使T-Bet蛋白和Gata-3蛋白异常表达。结论是麦胚球蛋白免疫机制是通过控制T-Bet、Gata-3蛋白表达影响Thl/Th2细胞亚群比例。毕振原等[26]采用脂多糖(LPS)干预巨噬细胞建立炎症细胞模型,对提取麦胚球蛋白的体外抗炎活性进行了探究。结果是麦胚球蛋白能显著降低经LPS诱导RAW264.7细胞因子TNF-α和NO的含量,并存在一定的剂量依赖关系。张文见等[27]构建了麦胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)修饰的脂质体,利用WGA与黏蛋白间的特异性结合将脂质体锚定于眼组织表面,实现结膜囊内定位释药,进一步促进药物在眼部吸收。将其修饰于脂质体表面有利于延长后者在眼部的滞留时间,进而改善药物的吸收。杨铭乾[12]利用盐提法提取的麦胚球蛋白中发现高丰度的热休克蛋白(HSPs),其分子量分布在 10~100 kDa,含有一个高度保守的N端和C端,其中N端为ATPase功能域,具有ATP降解活性;C端为可结合暴露的底物蛋白疏水残基的肽段结合域,并证实其为HSPs免疫作用的主要体现位点,与Mak等研究的应激蛋白分析结果接近。Kumar等[28]通过Orbitrap研究表明,HSP(HSP26,HSP70)和 CDPK 信号分子(丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶),在介导植物生育信号和逆境信号转导中具有重要作用,并进一步证明了HSPs可能是麦胚球蛋白的重要组成之一。纪小国[29]制备了一种麦胚蛋白止血贴,其中麦胚白蛋白片层有助于伤口的快速愈合,抑制细菌的生存,有止血、抑菌作用,避免伤口发炎、脓症,并自动调节压力,适用于静、动脉穿刺的伤口,达到调节伤口压力、快速止血的目的。吴丽[30]制备的麦胚活性蛋白对癌细胞增殖以及迁移有明显抑制作用,抗癌效果好。侯银臣[31]制备一种具有皮肤创伤恢复功能的小麦胚芽提取物,研究发现小麦胚芽提取物可以有效治疗皮肤损伤,有利于皮肤组织的快速修复,并能有效阻止创面细菌滋生,防止交叉感染,治愈后皮肤光滑,毛孔复生、不留疤痕,具有显著的治愈效果。
将小麦胚蛋白精深加工形成具有高附加值的生物活性物质越来越受到人们的关注,但与此相关的麦胚蛋白质组学的研究与应用面临3个主要问题:
(1)表达蛋白的全局性分析以及蛋白质组编目。麦胚细胞或结构组织中大规模蛋白质的含量以及动态表达是蛋白质组学的研究目标之一。高精度、高灵敏度的蛋白鉴定技术与分析方法,如抗体测序技术、蛋白质翻译后修饰技术、蛋白质结构表征、蛋白突变分析、蛋白质生物标识物、蛋白质固定化、蛋白质化学特性以及从样品分离纯化到信号通路分析的整合性,包括磷酸化蛋白质组学、化学蛋白质组学、细胞器蛋白质组学和信号通路蛋白质组学等,需要具有极高通量及卓越的可靠性和信息挖掘性[32]。
(2)大规模的蛋白质功能研究与验证[33]。蛋白质研究最大的挑战是鉴定每一个蛋白质以及它们的异构体的功能,蛋白质功能验证较常见的未知基因分析,需要从基因水平入手,将该基因敲除,观察其在功能组、蛋白组、转录组、形态等宏观水平的变化;将待研究的蛋白质的基因克隆到模式生物构建成融合表达载体是一项系统工程,确定功能的蛋白质,根据是否受体、酶、转运蛋白、调控蛋白等的不同进行后续的研究工作。
(3)建立完善“动态”的蛋白质调控网络。蛋白质组学反映了特定时间或环境下,细胞内动态变化的蛋白质组的组成成分、表达水平与修饰状态等问题,但仅靠蛋白质组的数据尚不能对生命现象的内在机制做出全面认知。建立完善“动态”蛋白质调控网不仅可以提供蛋白质之间的相互关系的信息,而且还可以和基因组学、转录组学、代谢组学、表型组学等多组学联合联系起来。需要通过生物信息学等多组学联合针对特定化学性质或者具有相似生理功能的一类代谢物进行检测,从而对这一类代谢物进行绝对定量研究,才能建立完整的蛋白质调控网络。
探讨麦胚蛋白质的性质与功能对小麦生物学研究具有直接影响,并可以利用麦胚蛋白为人类健康事业服务。结合当前麦胚蛋白质组学的研究以及麦胚蛋白资源开发、应用、推广及产业化的需求,今后麦胚蛋白质组学的研究具有广阔的前景,出现了“三新”局面,即新思路、新发展、新领域。新思路指的是利用蛋白质组学、生物信息学对麦胚蛋白进行功能分析与模拟,再利用传统医学手段进行验证,实现蛋白质研究的“高通量”和“低成本”,为麦胚蛋白乃至植物蛋白的开发提供新思路。Monafred等[34]曾在植物对疾病产生应答的信号过程,以及基因分析研究方面获得重要成果。这些研究数据为研究麦胚蛋白质互作提供了双重数据,使我们可以获得人类更有益的新型产品。研究人员利用鸟嘌呤核苷交换因子在拟南芥中激发Rop开关[35],它属于一种保护植物不受真菌感染的蛋白家族的逆渗透蛋白(osmotin),能够模仿缓解糖尿病和肥胖的激素,与体质量的控制有关,这是植物中发现的与在动物中所起作用相同的一组新蛋白。这些能够激发分子开关的植物蛋白和逆渗透蛋白为探知未被表征的麦胚蛋白提供一个研究思路。新发展是指麦胚蛋白质组学今后不光是单独作战,而是要与表型组学、基因组学、代谢组学、转录组学等各相关学科联合起来,建立起相互的联系,互为支撑,从多角度全面解释麦胚蛋白相关研究的分子机理,这样有助于更全面地理解麦胚相关生命活动的分子调控规律。尽管麦胚在干细胞领域研究进展缓慢,但在国际农业生物技术周报报道的藓类植物中聚硫蛋白(PcG)的基本功能与在植物和人类中的功能一样,主要是调节细胞分化[36]。这种不起眼的植物或许能为麦胚在干细胞研究领域提供一个方向,它能告诉如何更好地对医疗用干细胞进行设计提供了一个科学工具。新领域则是指今后麦胚蛋白质组学研究不仅仅局限于目前研究水平,更要深入到亚细胞及分子水平,关注直接发挥相应功能的蛋白分子以及更分子结构及结构域,就更容易阐明麦胚蛋白调节生命活动的内在机制及在生命过程中的作用,更好地解释麦胚研究上的科学问题。
通过研究麦胚蛋白质组学,一方面,可以了解小麦自身繁殖调控过程的基本信息,也为植物定向育种提供了科学工具,另一方面,对研究种子中可食用部分为人类保健、生物学及食品方面提供宝贵的新资源都有着十分重要的意义。基于麦胚球蛋白本身具有丰度低、构成复杂、功能多样等特点,人们迫切希望能够更深入地了解麦胚蛋白,而蛋白质组学在近年来所取得的巨大成就使其成为可能。随着麦胚蛋白质组学研究中的蛋白组成、分类、功能分析等生物学信息不断完善,以及多组学联合对麦胚蛋白研究的进一步拓展,麦胚蛋白质研究数据的不断丰富和生物信息学工具的完善,蛋白质组技术分析揭示麦胚蛋白的功能特征必将为深入研究其生物学功能提供不可或缺的线索。由此我们将能够寻找出与疾病的发生机制、诊断、治疗及预防相关的麦胚蛋白,并在此基础上利用分子药理模型等进行高通量的药物筛选,有望研制出治疗相关疾病,尤其是治疗免疫相关疾病的理想药物[37]。
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RESEARCH PROGRESS OF WHEAT GERM PROTEIN BASED ON PROTEOMICS
HUANG Jihong1,2,JI Xiaoguo1,TIAN Qing1,HUI Ming1,BIAN Ke3,LIN Jiangtao3
(1.School of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China;2.Food Industry Research Institute of Henan Province,Zhengzhou 450002,China;3.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)
Wheat embryo is the embryo of wheat caryopsis,which is known as "the source of life",has a very important physiological function. The protein content in wheat germ is around 30%,and mainly is albumin and globulin. Wheat germ proteomics studies the characteristics of wheat germ proteins at an overall level,including protein expression,classification,functional analysis,and protein interactions. In this paper,the classification,proteomics information and function of wheat germ protein were reviewed,and the application field and challenge of wheat germ proteomics were prospected. This review will provide a new idea for the development and utilization of wheat germ protein in the field of medicine and health products.
wheat germ protein;proteomics;function
TS201.2
A
1673-2383(2017)06-0115-08
http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20171226.1723.040.html
网络出版时间:2017-12-26 17:24:10
2017-04-22
河南工业大学谷物资源转化与利用省级重点实验室开放性课题(001254);河南工业大学人才支持计划(2015RCJH08)
黄继红(1965—),女,河南郸城人,教授,研究方向为农产品加工与贮藏。
*通信作者