钠钙交换器1对肝细胞肝癌增殖与侵袭的影响

田 慧， 杨毕伟， 赵志英， 黄佩新， 唐文清， 方婷婷， 夏景林,*

1. 复旦大学附属中山医院老年病科，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院肝肿瘤内科，上海 200032 3. 复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海 200032

·论著·

钠钙交换器1对肝细胞肝癌增殖与侵袭的影响

田 慧1， 杨毕伟2， 赵志英2， 黄佩新2， 唐文清2， 方婷婷3， 夏景林2,3*

1. 复旦大学附属中山医院老年病科，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院肝肿瘤内科，上海 200032 3. 复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海 200032

目的探讨钠钙交换器1(NCX1)在肝细胞肝癌(简称肝癌)侵袭和增殖中的作用及分子机制，为肝癌的临床诊治提供新思路。方法采用荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹法检测不同肝癌细胞系中NCX1的表达情况。构建NCX1干扰慢病毒载体和过表达慢病毒载体，并转染肝癌细胞。采用细胞迁移、侵袭实验观察NCX1对肝癌细胞迁移、侵袭的影响；采用细胞增殖实验观察NCX1对肝癌细胞增殖的影响；ELISA、Western印迹法检测NCX1相关蛋白的表达。结果高转移潜能肝癌细胞系(MHCC97H、HCCLM3)NCX1表达高于低转移潜能肝癌细胞系(HepG2、Huh7、SMMC-7721)，差异有统计学意义(P<0.05)。转染NCX1后，肝癌细胞侵袭及增殖能力明显增加(P<0.05)；细胞因子(TGF-β1、IL-6、TNF-α)分泌明显增多(P<0.05)；肝癌上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论NCX1体外可能通过升高肝癌细胞EMT相关蛋白表达促进肝癌生长、侵袭及转移，是潜在的肝癌诊治靶标。

钠钙交换器1；肝细胞肝癌；侵袭；增殖；上皮间质转化

肝细胞肝癌(简称肝癌)是国人最常见的消化系统恶性肿瘤之一，具有高复发率和死亡率，严重威胁国人健康，是目前临床医学研究的热点[1-2]。钙离子广泛参与调节细胞的生物学过程，如信号转导、神经递质释放、肌肉收缩、转录等[3]。钠钙交换器1(Na+/Ca2+-exchanger 1， NCX1)可高效地双向跨膜移动钙离子，发挥调节细胞钙离子浓度的作用[4]，参与钙离子依赖的一系列细胞生理、生化过程，与乳腺癌、胰腺癌及肝癌的发生发展具有潜在的相关性[5-8]，但相关机制并不明确。因此，本研究观察了NCX1在不同肝癌细胞系的表达差异及其对肝癌细胞侵袭和增殖能力的影响，并初步探讨NCX1表达促进肝癌细胞侵袭及转移的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 人肝癌细胞系SMMC-7721、Huh7、HepG2、MHCC97H、HCCLM3均由复旦大学肝癌研究所提供。40例肝癌及相应癌旁冰冻组织来自复旦大学附属中山医院肝外科根治性手术切除标本。NCX1抗体购自美国Abcam公司，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、Snail、β-actin抗体均购自美国CTS公司。DMEM高糖培养液、MEM高糖培养液和胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司。人肝癌细胞系SMMC-7721、Huh7、HepG2、MHCC97H和HCCLM3均在复旦大学肝癌研究所细胞房进行培养。SMMC-7721、Huh7、HepG2、MHCC97H和HCCLM3细胞均用含10%FBS的DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下常规培养。

1.2 Western印迹检测NCX1蛋白的表达 提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳后，蛋白转至PVDF膜上，一抗孵育4℃过夜，TBST洗膜，5%脱脂牛奶室温封闭，TBST洗膜，相应二抗室温孵育2 h，TBST洗膜后，加入ECL发光液曝光显影。实验重复3次。

1.3 荧光定量qRT-PCR检测NCX1 mRNA的表达 采用TRIzol试剂提取细胞RNA，并使用Prime ScriptTMRT Master Mix进行RNA反转录。SYBR Green荧光定量PCR进行PCR实验。PCR引物序列，NCX1：5′-CGT TCG GAA ATG TTG TTG TG-3′(F)，5′-ATT GCC AAA TGG GAG AAC AG-3′(R)；GAPDH： 5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′(F)，5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3′(R)。mRNA表达水平通过采用ΔΔCt方法计算，以GAPDH作为内参。实验重复3次。

1.4 NCX1干扰/过表达慢病毒载体的构建及转染 针对NCX1基因的siRNA片段序列为5′-TTC GTC TGC AAT GGT GAT T-3′[8]。根据siRNA序列，由上海吉凯基因化学技术有限公司构建pGC-SIL-GFP-shRNA-NCX1慢病毒载体，对高表达NCX1的肝癌细胞HCCLM3进行慢病毒转染。同时由上海吉凯基因化学技术有限公司设计并构建NCX1稳定过表达慢病毒载体：pGC-FU-GFP-NCX1，转染相对低表达NCX1的肝癌细胞SMMC-7721。根据细胞感染复数(MOI)值，在无血清DMEM培养基中加入适量慢病毒，培养24 h后更换为含10%FBS的DMEM培养基；病毒感染3 d后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，荧光率大于80%后，收集细胞提取总RNA，qRT-PCR法检测基因表达。提取细胞总蛋白，Western印迹检测蛋白表达。实验重复3次。

1.5 CCK-8细胞增殖实验 细胞常规培养至对数生长期，胰酶消化，制成细胞悬液，细胞计数，以细胞密度3 000/100 μL接种至96孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱培养。分别在0、24、48、72 h后换液，每孔加入含10% CCK-8试剂的新鲜完全培养液100 μL；置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h；酶标仪测定每孔450 nm光密度(D)值。实验重复3次。

1.6 Transwell实验观察细胞迁移及侵袭能力 采用8.0 μm孔径的聚碳酸酯膜24孔Transwell小室进行细胞迁移和侵袭实验。在细胞迁移实验中，将1×105细胞悬浮于100 μL含有1%FBS的DMEM培养液中，加入上室，在下室加入600 μL含10%FBS的DMEM培养液；置于培养箱中孵育24 h后，除去膜上表面的细胞，将下表面的迁移细胞在4%多聚甲醛中固定，在室温下用0.1%结晶紫染色15 min，PBS洗涤并晾干小室；置于倒置显微镜下，观察染色细胞，选取6个视野计数染色细胞，取平均值。细胞侵袭实验除了接种细胞前小室的聚碳酸酯膜需包被Matrigel胶外，其他步骤类似细胞迁移实验。实验重复3次。

1.7 ELISA实验测定细胞上清细胞因子的表达 于细胞生长对数期提取细胞上清液，2 680×g离心10 min，吸取上清液。采用双抗体夹心ELISA法检测TGF-β1、IL-6、TNF-α表达水平，步骤参照说明书进行(ELISA试剂盒购自美国Abcam公司)。实验重复3次。

1.8 NCX1对肝癌细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达的影响 提取HCCLM3-shNCX1、HCCLM3-MOCK、SMMC-7721-NCX1和SMMC-7721-MOCK 细胞总蛋白，通过Western印迹检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、Snail的表达。实验重复3次。

2 结 果

2.1 不同肝癌细胞系NCX1的表达 结果(图1)表明：NCX1 mRNA及蛋白在人肝癌细胞系SMMC-7721、Huh7、HepG2、MHCC97H和HCCLM3细胞中均有表达。高转移潜能肝癌细胞系MHCC97H、HCCLM3中NCX1 mRNA及蛋白表达高于非转移性肝癌细胞系SMMC-7721、Huh7、HepG2。

图1 不同肝癌细胞系NCX1 mRNA(A)及蛋白(B)的表达

2.2 肝癌及癌旁正常组织NCX1 mRNA的表达 qRT-PCR检测结果(图2)表明：肝癌及癌旁正常组织中均可检测到NCX1 mRNA的表达；与癌旁组织相比，肝癌组织NCX1 mRNA表达水平更高(P<0.05)。

图2 qRT-PCR检测肝癌及对应的癌旁组织中NCX1 mRNA表达

2.3 肝癌细胞慢病毒转染低/过表达NCX1的表达 qRT-PCR、Western印迹结果(图3)表明：NCX1低及过表达均在80%以上(P<0.01)，成功建立HCCLM3-shNCX1稳定细胞株和SMMC-7721-NCX1稳定细胞株。

图3 慢病毒转染肝癌细胞后干扰/过表达NCX1基因及蛋白的表达

2.4 NCX1促进肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移 结果(图4)表明：与HCCLM3-MOCK组相比，HCCLM3-shNCX1组细胞增殖能力明显减弱(P<0.05)；与SMMC-7721-MOCK组相比，SMMC-7721-NCX1组细胞增殖能力明显增强(P<0.05)。下调NCX1表达后，肝癌细胞HCCLM3的侵袭能力和迁移能力明显下降(P<0.05)；上调NCX1表达后，肝癌细胞SMMC-7721的侵袭能力和迁移能力明显增强(P<0.05)。

图4 NCX1促进肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移

2.5 NCX1促进肝癌细胞分泌细胞因子 ELISA实验结果(图5)显示：HCCLM3-shNCX1细胞上清液中TGF-β1、IL-6、TNF-α含量低于HCCLM3-MOCK细胞上清液，差异有统计学意义(P<0.05)；SMMC-7721-NCX1细胞上清液中上述细胞因子含量高于SMMC-7721-MOCK细胞上清液，差异有统计学意义(P<0.05)。

图5 NCX1促进肝癌细胞分泌细胞因子的表达

2.6 NCX1对肝癌细胞EMT相关蛋白表达的影响 结果(图6)显示：HCCLM3-shNCX1细胞中E-cadherin表达高于HCCLM3-MOCK，而N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、Snail的表达低于HCCLM3-MOCK，差异有统计学意义(P<0.05)。SMMC-7721-NCX1细胞E-cadherin的表达低于SMMC-7721-MOCK，而N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、Snail的表达高于SMMC-7721-MOCK，差异有统计学意义(P<0.05)。

图6 NCX1对肝癌细胞EMT相关蛋白表达的影响

3 讨 论

HCC患者预后不良的主要原因是延误诊断、高转移率和高复发率[9]。因此，治疗晚期肝癌的目的是克服肝癌对治疗的抵抗性并防止疾病复发。NCX1对调节细胞钙离子浓度重要而独特，参与了许多钙离子依赖的细胞生理、生化过程。目前NCX1与肿瘤的关系日益受到重视。有研究[5]显示，抑制NCX1活性可促进前列腺癌细胞死亡，从而达到抑制前列腺癌进展的作用。另有研究[6]显示，NCX1在TGF-β1诱导乳腺癌细胞EMT过程中起到至关重要的作用。Tang等[7]发现，NCX1/Ca2+/β-catenin信号通路参与胰腺癌的发生发展过程。Xu等[8]研究发现，NCX1参与了IL-6介导的肝癌细胞增殖、侵袭及迁移的促进作用。NCX1还与恶性胶质瘤、阴茎癌等恶性肿瘤密切相关[10-11]。

EMT是一个复杂的分子和细胞过程，上皮细胞失去其分化特性并获得包括运动性、侵入性、逃避免疫细胞和抵抗细胞凋亡等间充质细胞的功能[12]。EMT可能是灾难性的，因为EMT赋予分化的固着的上皮细胞迁移和侵袭性，从而启动肿瘤转移[13-14]。已有研究[15-17]显示，肝癌TGF-β1、IL-6、TNF-α等细胞因子与肝癌EMT相关，并促进肝癌的进展，并且E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1和Snail等EMT相关蛋白与肝癌的发生发展密切相关。本研究结果发现，NCX1促进肝癌细胞分泌细胞因子TGF-β1、IL-6、TNF-α，并且促进肝癌细胞N-cadherin、Vimentin、TGF-β1和Snail的表达，抑制E-cadherin的表达。结果提示，NCX1可能是肝癌发生EMT的诱导因子，在肝癌中EMT的发生起到重要作用，从而促进肝癌的发生发展。

综上所述，本研究发现NCX1可能通过促进肝癌细胞的EMT进程，从而增强肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，其可能成为肝癌早期诊断和治疗的靶标。

[ 1 ] MALUCCIO M, COVEY A. Recent progress in understanding, diagnosing, and treating hepatocellular carcinoma[J]. CA Cancer J Clin, 2012,62(6):394-399.

[ 2 ] SIEGEL R L, FEDEWA S A, MILLER K D, et al. Cancer statistics for Hispanics/Latinos, 2015[J].CA Cancer J Clin, 2015,65(6):457-480.

[ 3 ] CARAFOLI E, GENAZZANI A, GUERINI D. Calcium controls the transcription of its own transporters and channels in developing neurons[J].Biochem Biophys Res Commun, 1999,266(3):624-632.

[ 4 ] BLAUSTEIN M P, LEDERER W J. Sodium/calcium exchange: its physiological implications[J]. Physiol Rev, 1999,79(3):763-854.

[ 5 ] LONG Z, CHEN B, LIU Q, et al. The reverse-mode NCX1 activity inhibitor KB-R7943 promotes prostate cancer cell death by activating the JNK pathway and blocking autophagic flux[J]. Oncotarget, 2016,7(27):42059-42070.

[ 6 ] MAHDI S H, CHENG H, LI J, et al. The effect of TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition on the expression of intracellular calcium-handling proteins in T47D and MCF-7 human breast cancer cells[J]. Arch Biochem Biophys, 2015,583:18-26.

[ 7 ] TANG B, CHOW J Y, DONG T X, et al. Calcium sensing receptor suppresses human pancreatic tumorigenesis through a novel NCX1/Ca2+/β-catenin signaling pathway[J]. Cancer Lett, 2016,377(1):44-54.

[ 8 ] XU J, JI B, WEN G, et al. Na+/H+exchanger 1, Na+/Ca2+exchanger 1 and calmodulin complex regulates interleukin 6-mediated cellular behavior of human hepatocellular carcinoma[J]. Carcinogenesis, 2016,37(3):290-300.

[ 9 ] MALEK N P, SCHMIDT S, HUBER P, et al. The diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Dtsch Arztebl Int, 2014,111(7):101-106.

[10] SONG M, CHEN D, YU S P. The TRPC channel blocker SKF 96365 inhibits glioblastoma cell growth by enhancing reverse mode of the Na+/Ca2+exchanger and increasing intracellular Ca2+[J]. Br JPharmacol, 2014,171(14):3432-3447.

[12] POLYAK K, WEINBERG R A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits[J]. Nat Rev Cancer, 2009,9(4):265-273.

[13] NIETO M A. Epithelial plasticity: a common theme in embryonic and cancer cells[J]. Science, 2013,342(6159):1234850.

[14] THIERY J P, ACLOQUE H, HUANG R Y, et al. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J]. Cell, 2009,139(5):871-890.

[15] KAIMORI A, POTTER J J, CHOTI M, et al. Histone deacetylase inhibition suppresses the transforming growth factor beta1-induced epithelial-to-mesenchymal transition in hepatocytes[J]. Hepatology,2010,52(3):1033-1045.

[16] MITRA A, YAN J, XIA X, et al. IL6-mediated inflammatory loop reprograms normal to epithelial-mesenchymal transition+ metastatic cancer stem cells in preneoplastic liver of transforming growth factor beta-deficient β2-spectrin+/-mice[J].Hepatology, 2017,65(4):1222-1236.

[17] ZHU Y, CHENG Y, GUO Y, et al. Protein kinase D2 contributes to TNF-α-induced epithelial mesenchymal transition and invasion via the PI3K/GSK-3β/β-catenin pathway in hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget, 2016,7(5):5327-5341.

The role and mechanisms of NCX1 on proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma

TIAN Hui1, YANG Bi-wei2, ZHAO Zhi-ying2, HUANG Pei-xin2, TANG Wen-qing2, FANG Ting-ting3, XIA Jing-lin2,3*

1. Department of Gerontology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2. Department of Liver Neoplasms, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 3. Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To investigate the role and molecular mechanism of Na+/Ca2+exchanger 1 (NCX1) in the invasion and proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC), and to provide new therapeutic targets for the clinical diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma.MethodsQuantitative real-time PCR (qRT-PCR) and Western blotting were used to detect NCX1 mRNA and protein expression in different HCC cell lines. Lentiviral vectors pGC-SIL-GFP-shRNA-NCX1 and pGC-FU-GFP-NCX1 were constructed and transfected into hepatoma cells. Cell migration and invasion experiments were used to observe the effect of NCX1 on the migration and invasion of HCC cells; cell proliferation assay was used to observe the effect of NCX1 on the proliferation of hepatoma cells; Western blotting and ELISA were used to detect the expressions of NCX1-related proteins.ResultsThe expression of NCX1 in high metastatic potential HCC cell lines (MHCC97H, HCCLM3) was higher than that of low metastatic potential HCC cell lines (HepG2, Huh7, SMMC-7721), and the difference was statistically significant (P<0.05). After transfection of NCX1, the invasion and proliferation ability of HCC cells increased significantly (P<0.05); the secretion of cytokines (TGF-β1, IL-6 and TNF- α) increased significantly (P<0.05); the expressions of epithelial-mesenchymal transition (EMT) related proteins in HCC cells were significantly increased (P<0.05).ConclusionsNCX1 can promote the growth, invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by increasing the expressions of EMT-related proteins in HCC cells, and it is a potential target for the diagnosis and treatment of liver cancer.

Na+/Ca2+exchanger 1; hepatocellular carcinoma; invasion; proliferation; epithelial-mesenchymal transition

2017-04-08接受日期2017-07-29

国家自然科学基金面上项目(81572395).Supported by National Natural Science Foundation of China(81572395).

田 慧，博士，住院医师. E-mail: tianhui_2013@126.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: xia.jinglin@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170291

R 735.7

A

[本文编辑] 廖晓瑜，贾泽军