盆腔脏器脱垂患者主韧带和宫骶韧带组织中神经肽Y、神经肽Y受体的表达变化及意义

陈霞，詹安娜，蒋丽萍

(吉安市妇幼保健院，江西吉安343000)

盆腔脏器脱垂患者主韧带和宫骶韧带组织中神经肽Y、神经肽Y受体的表达变化及意义

陈霞，詹安娜，蒋丽萍

(吉安市妇幼保健院，江西吉安343000)

盆腔脏器脱垂；神经肽Y；神经肽Y受体；主韧带；宫骶韧带

女性盆腔脏器脱垂是由各种原因导致的盆底支持组织薄弱，造成盆腔器官下降移位引发器官的位置及功能异常；其以外阴部块物脱出为主要症状，伴或不伴有排尿、排便异常，外阴部出血、炎症等，不同程度地影响患者的生活质量[1]。盆腔脏器脱垂可能是解剖、生理、遗传、生活方式和分娩等众多因素相互影响，并最终导致盆底功能障碍。有2/3的经产妇在解剖学上有盆腔脏器脱垂迹象，但大部分妇女无症状[2～4]。研究认为，神经损伤、神经递质减少或其他原因造成盆底血管改变，血流灌注不足，导致盆腔脏器相应的结构代谢改变和成分变化，从而发生盆腔脏器脱垂[5]。神经肽Y是重要的血管活性肽，是由36个氨基酸组成的多肽，通过激活不同的受体发挥生物学作用。研究显示，盆腔脏器脱垂患者肛提肌中神经肽Y、血管活性肠肽和P物质等肽能神经显著减少甚至缺失。可见神经肽Y在盆腔脏器脱垂的发病中可能起重要作用[6]。2015年10月～2017年4月，本研究对不同程度盆腔脏器脱垂患者不同部位神经肽Y及其受体表达进行观察，并探讨二者表达变化的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选盆腔脏器脱垂患者50例，均为子宫脱垂，均经手术治疗。患者年龄33～75(62.07±10.34)岁。按盆腔脏器脱垂定量评估体系(POP-Q)对盆腔脏器脱垂分度：Ⅰ度6例，Ⅱ度20例，Ⅲ度14例，Ⅳ度10例。将Ⅰ、Ⅱ度作为脱垂1组，Ⅲ、Ⅳ度作为脱垂2组。脱垂1组年龄34～75(60.07±8.85)岁；孕次(2.0±0.7)次，产次(1.9±0.4)次；BMI(23.7±2.4)kg/m2；脱垂2组年龄33～73(63.01±9.95)岁；孕次(2.5±0.9)次，产次(2.3±0.6)次；BMI(24.9±1.8)kg/m2。同期选择宫颈癌患者30例作为对照组，均无盆腔脏器脱垂，均经手术治疗。年龄37～72(62.19±10.37)岁；孕次(2.2±0.6)次，产次(2.0±0.7)次；BMI(23.7±2.1)kg/m2。患者均已婚；有经阴道分娩史；近3个月内无激素类药物使用史；无其他结缔组织疾病、雌激素相关性疾病、周围神经疾病及脊柱外伤史。三组年龄、孕次、产次及BMI有可比性。

1.2 组织标本的提取及处理 三组均于术中切除主韧带和宫骶韧带组织标本，于靠近子宫动脉下方1 cm处取主韧带组织，于韧带与宫颈连接处以外0.5 cm处取宫骶韧带。一部分经甲醛固定，石蜡包埋，另外一部分放入Eppendorf管中保存。

1.3 主韧带和宫骶韧带组织神经肽Y蛋白表达的检测 采用免疫组化法。将组织切片室温下经二甲苯、梯度乙醇、蒸馏水脱蜡，3%过氧化氢浸泡10 min,PBS冲洗×3次×3 min，经胃蛋白酶消化60 min,蒸馏水冲洗3 min,加血清、一抗，于4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗×3次×5 min，加二抗，37 ℃放置30 min，PBS冲洗×3次×5 min。DAB显色，苏木素复染，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化3 s，自来水反蓝30 min。常规脱水、透明、封片、镜检。免疫组化结果判断：在200倍光学显微镜下观察，每张切片随机抽取5个视野进行计数。按细胞有无显色或显色深浅计分：无显色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，黄褐色计3分；按显色细胞比例计分：显色细胞<1%计0分，1%～10%计1分，11%～50%计2分，51%～100%计3分。根据阳性细胞染色深浅和阳性细胞占组织细胞总数的百分数进行计分，以两者计分的乘积作为最终判断标准：0为阴性；1～4为弱阳性；6为阳性；9为强阳性；≥6为高表达，<6为低表达或不表达。

1.4 主韧带和宫骶韧带组织Y1受体、Y2受体mRNA表达的检测 采用RT-PCR法。取出液氮标本，每100 g组织中加入TRIzol 1 mL,提取总RNA。取RNA 1.25 μL经反转录合成cDNA。PCR反应条件：94 ℃预变性、3 min；94 ℃、40 s,退火40 s;72 ℃、40 s，35个循环。Y1受体退火温度为52.5 ℃，Y2受体退火温度为50.7 ℃。扩增后72 ℃延伸7 min。实验用引物序列：Y1受体上游引物：5′-GGTCTTIGGTGAGGCGAT-3′，下游引物：5′-GCTGTGAGGTGGCAGAGC-3′；Y2受体上游引物：5′-CTGCTCCATCATCTTGCT-3′，下游引物：5′-CTGGCTGTCAATGTCAAC-3′；内参上游引物：5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3′，下游引物：5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3′。通过凝胶成像分析软件检测神经肽Y受体mRNA的表达，其相对表达量为神经肽Y受体PCR灰度值/内参PCR灰度值。

2 结果

2.2 各组主韧带与宫骶韧带组织中Y1受体、Y2受体 mRNA表达比较 见表1。

表1 各组主韧带与宫骶韧带组织中神经肽Y受体mRNA表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与脱垂1组比较，#P<0.05。

2.3 主韧带与宫骶韧带组织中Y1受体 mRNA表达与Y2受体mRNA表达的相关性 主韧带组织中Y1受体 mRNA表达与Y2受体 mRNA表达呈正相关(r=0.479,P<0.05)，宫骶韧带组织中Y1受体 mRNA表达与Y2受体 mRNA表达无相关性(r=0.173,P>0.05)。

3 讨论

多层肌肉和筋膜组成女性盆底，盆底中有尿道、阴道和直肠穿出。子宫、膀胱、直肠等盆腔器官正常位置的保持有赖于盆底组织的支持。盆腔脏器脱垂的主要原因为盆底肌肉和筋膜组织的薄弱[7]。盆腔脏器脱垂的影响因素包括易感因素、诱发因素、促发因素、失代偿因素，以上均可导致盆底支持薄弱。绝经后的盆底组织退化性改变、阴道分娩损伤、有腹压增高的疾病是盆腔脏器脱垂最常见的发病原因[8]。分娩过程中软产道及其周围的盆底组织扩张，导致肌纤维拉长、撕裂，损伤盆底神经，尤其是产后过早参加体力劳动，盆底组织张力恢复缓慢。目前随着产科技术的提高，因为产伤造成的盆底功能障碍已明显减少。随着社会人口的老龄化，因为绝经后雌激素水平下降及盆底肌肉韧带组织支持力下降，导致盆腔脏器脱垂成为中老年妇女的常见病，一定程度地影响妇女生活质量[9]。根据发生部位，盆腔器官脱垂分为阴道前壁膨出、阴道后壁膨出、阴道顶脱垂、子宫脱垂、肠疝。部分患者同时存在多部位脱垂。轻度盆腔器官脱垂患者一般无不适，但是重度患者可有不同程度的腰骶部酸痛或下坠感、阴道块状物脱出、站立过久或劳累后症状明显，可伴有排便、排尿困难。本研究对神经肽Y及其受体在盆腔脏器脱垂患者主韧带和宫骶韧带组织的表达变化进行观察，以探讨神经肽Y及其受体在盆腔脏器脱垂发生发展中的作用，为临床诊治提供参考。

神经肽Y是一种维持内环境稳态的激素，与应激关系密切，广泛存在于外周和中枢，在应激引起的心血管疾病中起重要调节作用；在中枢有抗焦虑、癫痫，抑制生殖、肌肉兴奋、交感兴奋等作用，可使机体血压、心率、代谢下降；可促进食欲[10，11]；其外周主要作用是促进血管平滑肌收缩和血管再生，对小动脉有收缩作用，能参与生殖道局部血流的神经调节。神经肽Y受体属于跨膜7次的G蛋白偶联受体，目前发现在人体中有5种受体，其中Y1、Y2、Y4、Y5受体均已经被克隆。Y1受体主要位于突触后膜，分布于血管平滑肌，与血管收缩和血管平滑肌再生相关，Y2和Y5受体位于突触前膜，抑制去甲肾上腺素的释放，与血管生成及再生相关。Y4受体主要与进食行为相关。神经肽Y能上调自身受体表达。突触后的受体Y1直接或间接地介导了血管收缩，其作用机制可能为增强去甲肾上腺素的作用及刺激平滑肌细胞增殖。Y1、Y5受体在粥样斑块形成过程中发挥重要作用。Y2受体通过本身或与Y5受体协同作用促进粥样硬化斑块的形成；二者可刺激内皮细胞增生、迁移和毛细血管形成。除具有致粥样斑块形成的作用外，Y2受体还能抑制突触前的去甲肾上腺素释放[12]。

本研究结果发现，各组主韧带、宫骶韧带组织均有神经肽Y及其Y1、Y2受体的表达。脱垂1、2组主韧带与宫骶韧带组织中神经肽Y蛋白阳性表达率低于对照组，说明盆腔脏器脱垂患者主韧带与宫骶韧带组织中神经肽Y蛋白呈低表达；脱垂2组主韧带与宫骶韧带组织中神经肽Y蛋白阳性表达率低于脱垂1组，说明盆腔脏器脱垂越严重其主韧带与宫骶韧带组织中神经肽Y蛋白阳性表达率越低。可见，神经肽Y可能参与盆腔脏器脱垂的发生发展。经RT-PCT法检测发现，脱垂2组主韧带组织中Y1受体 mRNA表达高于对照组及脱垂1组,而脱垂1组与对照组比较差异无统计学意义；脱垂1、2组宫骶韧带组织中Y2受体 mRNA表达比较差异无统计学意义，脱垂1组宫骶韧带组织中Y1受体 mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义，脱垂2组宫骶韧带组织中Y1受体 mRNA表达高于对照组。Y1受体在主韧带、宫骶韧带组织中表达升高，且盆腔脏器脱垂越严重表达越高，说明Y1受体参与盆腔脏器脱垂发生发展。脱垂1、2组主韧带与宫骶韧带组织中Y2受体 mRNA表达有升高趋势，但与对照组比较差异无统计学意义，脱垂1、2组之间比较差异无统计学意义。这可能与本研究样本小有关。主韧带组织中Y1受体 mRNA表达与Y2受体 mRNA表达呈正相关，宫骶韧带组织中Y1受体 mRNA表达与Y2受体 mRNA表达无明显相关性。说明主韧带组织中两种受体可能协同参与了疾病的发生发展。此外，由于受体的作用复杂、交互，不能单一分析单个受体的影响。神经肽Y系统只是韧带中的一小部分，其变化对韧带的改变及疾病的发生可能有作用，但也是有限的。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.019

R713.3

B

1002-266X(2017)45-0059-03

江西省卫生计生委科技计划项目(20143303)。

陈霞(E-mail:yiyuan170815@163.com)

2017-08-16)