香砂六君丸对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏线粒体的影响

娄林洁，游艳婷，马柯，陈泽伟，孙晓敏，周琳

（1.温州医科大学附属第一医院 中医科，浙江 温州 325015；2.南方医科大学 中医药学院，广东广州 510515；3.南方医科大学南方医院 内分泌科，广东 广州 510515）

香砂六君丸对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏线粒体的影响

娄林洁1，游艳婷2，马柯2，陈泽伟2，孙晓敏2，周琳3

（1.温州医科大学附属第一医院 中医科，浙江 温州 325015；2.南方医科大学 中医药学院，广东广州 510515；3.南方医科大学南方医院 内分泌科，广东 广州 510515）

目的：研究香砂六君丸对非酒精性脂肪肝大鼠模型肝脏组织内线粒体的影响。方法：24只正常成年雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和治疗组。采用高脂饲料喂养法来制作非酒精性脂肪肝大鼠模型，给予香砂六君丸（1.35 g·kg-1·d-1）灌胃4周治疗后取材。检测各组大鼠的体质量、肝脏湿重、肝脏HE染色结果、血液生化指标。用Real time PCR法、紫外分光光度计法对肝脏组织线粒体DNA（mtDNA）拷贝数、线粒体复合物I、IV活性的变化进行测定。结果：与正常对照组相比，模型组大鼠肝脏湿重和质量指数（肝脏湿重/体质量）显著升高，血清总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平明显升高，肝脏组织mtDNA显著降低，肝脏组织线粒体复合物I、IV活性显著降低，差异均有统计学意义（p＜0.05）。与模型组大鼠相比，治疗组大鼠肝脏湿重和质量指数显著降低，血清TC和LDL-C水平明显降低，肝脏组织mtDNA显著升高，肝脏组织线粒体复合物I、IV活性显著升高，差异均有统计学意义（p＜0.05）。肝脏HE染色结果显示，模型组大鼠肝细胞出现大量脂肪空泡，细胞核固缩；治疗组大鼠肝细胞出现脂肪空泡量显著减少，细胞核固缩情况减轻。结论：香砂六君丸可能通过调节mtDNA拷贝数与呼吸链酶复合物活性对非酒精性脂肪肝起到治疗作用。

非酒精性脂肪肝；香砂六君丸；线粒体呼吸链酶复合物；DNA，线粒体

随着经济的发展，人们的饮食与生活习惯也随之改变。非健康的饮食会引起非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发生[1]。现如今，NAFLD已经逐渐成为发病率最高的肝脏疾病之一，吡咯列酮、罗格列酮等噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂为临床NAFLD经典用药，但该类药物具有潜在的不良反应，如体质量的增加以及心血管病风险的增加以及停药以后肝酶的反弹等。中医药防治NAFLD积累了丰富的经验。其中，香砂六君丸为补脾益气，燥湿化痰的代表方剂，对NAFLD有较好疗效，但其治疗机制尚未完全阐明[2]。线粒体为细胞内氧化呼吸与产能的主要场所，通过氧化磷酸化过程提供维持正常生理活动的能量，NAFLD诱导的线粒体活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量产生并激活蛋白激酶C、己糖胺和多元醇等途径是糖尿病慢性并发症发生、发展的共同机制[3]。因此，本研究通过香砂六君丸治疗NAFLD大鼠，观察大鼠肝脏组织线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷贝数与呼吸链复合体表达的改变，探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠24只，8周龄，体质量（180±20）g，购于广东省实验动物中心，动物许可证号：SCXK（粤）2013-0002，饲养于广州体育科学研究所实验动物中心SPF级动物房，实验过程符合广州体育科学研究所动物伦理学标准。自由摄食与饮水，温度（22±1）℃，湿度（50±5）%，每天光照与黑夜时间各为12 h。

1.2 主要试剂与仪器 香砂六君丸浓缩丸购自河南仲景宛西制药股份有限公司；AU5800全自动生化分析仪购自美国贝克曼库尔特公司；Blood＆Cell Culture mini Kit试剂盒购自德国Qiagen公司；PCR引物购自南京金斯瑞生物科技有限公司；线粒体复合物I和IV的相关试剂均购自美国Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒与ECL化学发光试剂盒均购自美国Thermo公司；CFX-96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；特氟龙组织研磨器购自美国Wheaton公司；全波长多功能酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 分组、造模及给药：24只大鼠适应性饲养1周后随机分成3组：正常对照组、模型组和治疗组，每组8只。模型组与治疗组采用高脂饲料（80%基础饲料、18%猪油和2%胆固醇）喂养来制作NAFLD大鼠模型[3]。8周后，治疗组给予香砂六君丸浓缩丸，以剂量1.35 g·kg-1·d-1（按照人体等效剂量计算并结合预实验）连续灌胃4周；正常对照组与模型组予以等体积的溶媒，连续灌胃4周。实验结束后麻醉处死大鼠，取肝脏组织标本。

1.3.2 生化指标检测：10%水合氯醛（0.5 mL·kg-1）麻醉大鼠后，腹腔腹主静脉取全血6 mL，分别注入肝素抗凝管6 mL，迅速混匀，低温离心（3 000 r/min）后上机检测。

1.3.3 肝脏组织病理变化检测：将新鲜肝脏组织在冰磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中反复洗涤，在4%中性甲醛溶液（pH 7.4）中固定，乙醇梯度脱水，切片，HE染色，观察肝脏组织形态学变化。

1.3.4 Real time PCR检测肝脏组织mtDNA拷贝数的表达量：取大鼠肝脏组织，Blood＆Cell Culture mini Kit提取肝脏组织总DNA，测定浓度后调整成一致浓度，选取线粒体基因编码ND1为目的基因，核基因编码的β-actin为内参基因，ND1基因（正向序列：5’-ATTCTAGCCACAAGTCTTT-3’，反向序列：5’-GGAGGACGGATAAGAGGATAAT-3’）与β-actin基因（正向序列：5’-GAAATCGTGCGTGATTAAAG-3’，反正向序列：5’-ATCGGAACCGCTCATTG-3’）是通过NCBI全序列设计。扩增反应体系：10 μL SYBR Green Supermix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，DNA模板2 μL，ddH2O为7 μL。PCR仪中Real time PCR反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，39个循环。根据NTC反应有无荧光信号检出，并结合熔解曲线确认反应体系是否有污染。以β-actin为内参，计算样品中mtDNA的相对表达量。

1.3.5 线粒体的提取：线粒体提取方法参照文献[4]：剪取加入组织冻存液冻存的肝脏组织约2 g，组织复苏液快速解冻组织（体积比为1∶4）。 4 ℃条件下匀浆棒反复匀浆50次，差速离心法提取线粒体，最后的沉淀使用预冷的线粒体缓冲液重悬，即为粗提取的线粒体。

1.3.6 复合物酶活性测定：采用BCA法检测线粒体浓度，调成一致浓度后液氮反复冻融3次，破碎线粒体。根据文献[5]配制复合物体系I和IV，使用紫外分光光度计分别在340 nm和550 nm条件下进行检测。

1.4 统计学处理方法 使用SPSS20.0软件对数据进行统计分析。数据以 ±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 正常组大鼠体格健壮、反应与行动迅速敏捷、被毛光泽紧密。高脂饮食8周的大鼠出现体质量增加、活动减少精神状态疲乏、皮毛枯黄，与正常对照组大鼠体质量相比，模型组大鼠体质量显著升高（F=8.892，P＜0.01）符合NAFLD大鼠的形态表现，提示大鼠模型造模成功。与模型组大鼠比较，治疗组大鼠体质量有一定程度的降低（F=11.332，P＜0.01），反应力与活动情况有所改善，被毛光泽度增加。见表1。

2.2 香砂六君子丸对NAFLD大鼠肝脏质量的影响与正常对照组相比，模型组大鼠肝脏组织湿重增加，并且相应质量指数（肝脏湿重/体质量）也显著升高，差异均有统计学意义（F=7.371、9.164，P＜0.01）。较模型组，治疗组大鼠体质量与肝脏湿重增加情况均显著减轻，并且相应质量指数也显著降低（F=13.668、11.032，P＜0.05）。见表1。

表1 3组大鼠体质量、肝脏湿重和质量指数比较（n=8，±s）

2.3 香砂六君子丸对NAFLD大鼠血清生化指标的影响 造模后第12周时，大鼠血清生化检测结果显示，模型组血清总胆固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平明显高于正常对照组（F=6.917、8.332，P＜0.05）；而甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、葡萄糖（glucose）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）在2组大鼠间差异均无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比，治疗组大鼠血清TC和LDL-C水平明显降低（F=9.362、11.733，P＜0.05），而TG、HDL-C、glucose、AST、ALT在2组大鼠间差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 3组大鼠血清生化指标比较（n=8， ±s）

2.4 香砂六君子丸对NAFLD大鼠肝脏组织结构的影响 肝脏组织HE染色后光镜下观察：正常对照组大鼠肝小叶和肝细胞结构正常，肝细胞排列整齐，无肿胀和脂肪变性，无炎性细胞浸润；模型组大鼠与正常对照组比，肝脏脂肪变性明显，肝细胞间呈现大量脂肪滴，部分肝细胞呈气球样变，而治疗组大鼠较模型组肝细胞脂肪滴及气球样变减少，无明显炎性细胞浸润，细胞结构趋于正常，见图1。

2.5 香砂六君子丸对NAFLD大鼠肝脏mtDNA拷贝数的影响 与正常对照组（1.001±0.080）相比，模型组大鼠肝脏组织mtDNA拷贝数（0.669±0.069）显著降低（F=10.171，P＜0.01），治疗组较模型组大鼠mtDNA拷贝数（0.864±0.065）显著升高（F=8.221，P＜0.01）。

图1 3组大鼠肝脏HE染色结果（×200）

2.6 香砂六君子丸对NAFLD大鼠肝脏线粒体复合物活性的影响 模型组大鼠肝脏组织线粒体内复合物I和IV的活性较正常对照组均显著降低（F= 14.221、9.873，P＜0.05）；治疗组较模型组复合物I和IV的活性显著升高（F=11.065、13.699，P＜0.05），但与正常对照组相比，2组复合物I和IV的活性差异无统计学意义（F=2.331、1.986，P＞0.05），见表3。

表3 各组大鼠肝脏组织线粒体复合物活性比较（n=8，

表3 各组大鼠肝脏组织线粒体复合物活性比较（n=8，

与正常对照组比：aP＜0.01；与模型组比：bP＜0.01

组别 线粒体复合物I 线粒体复合物IV正常对照组 0.563±0.088 2.638±0.124模型组 0.188±0.055a 1.285±0.186a治疗组 0.312±0.038b 1.937±0.143b F 28.309 24.667 P 0.001 0.007

3 讨论

NAFLD包括肝细胞脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化及肝硬化等一系列病理变化。现如今，该病随着人们的生活品质的提高发病率也逐渐增加，尤其在发达国家人群最为突出[6]。临床研究发现NAFLD为代谢紊乱引起的代谢综合征的肝脏表现，严重时会导致糖与脂肪代谢异常，并诱发心脑血管系统以及内分泌系统相继发生病变[7]。本研究发现较正常对照组，模型组大鼠血清TC和LDL-C水平明显升高，肝脏组织结构出现大量空泡化，细胞核固缩，表明NAFLD对肝脏造成了一定的损伤。

作为机体各项生命活动的核心与枢纽，线粒体主要为能量代谢和遗传变异两大机能提供了基本场所。线粒体的功能是否正常，在一定程度直接决定了细胞所在的脏腑以及整个机体的生命活动[8]。与核DNA不同，mtDNA无组蛋白包被，且线粒体内酶修复的系统并不完善，更容易受到氧化磷酸化过程产生的ROS损伤而引起高发突变[9]。线粒体结构损伤、电子传递链被抑制、酶活性降低、mtDNA的突变或缺失等都会引起能量代谢障碍，进而出现相互损伤的系列过程，即为线粒体功能异常[10-11]。较正常对照组，模型组大鼠mtDNA含量显著降低，表明NAFLD造成了线粒体数量减少，mtDNA结构损伤，有线粒体参与的相关能量代谢功能减弱。

氧化磷酸化是由线粒体呼吸链完成的，线粒体内膜呼吸链是位于线粒体的一个重要酶系，由四个大分子跨膜蛋白（复合物I、I I、I I I和IV）和辅酶Q以及细胞色素C构成的。mtDNA在复合物I和IV上分别编码了7个和3个亚单位，占mtDNA上总的蛋白编码区的83.6%。复合物I作为线粒体在呼吸链中重要的组成成分，减弱其活性可以削弱呼吸链整体传递电子与产生能量的能力；复合物IV是呼吸链中的关键酶之一，它又是最脆弱、最不稳定、最易受损的酶，其酶活性的改变将直接造成整个呼吸链的功能变化[12]。在氧化磷酸化过程中，复合物I与复合物IV直接影响线粒体的能量代谢功能。较正常对照组，模型组复合物I与复合物IV活性显著性降低，表明NAFLD不仅引起线粒体结构损伤，也一定程度影响了线粒体的功能，导致氧化呼吸的过程减弱。模型组大鼠mtDNA以及线粒体氧化呼吸链的损伤导致了更多的电子泄漏，从而导致ROS产生量增加，其环状结构断裂，编码的相关呼吸链上的亚基合成减少，能量代谢减弱，发生氧化应激反应，改变分子的结构，能够破坏核酸、蛋白质和脂质等生物大分子，最终导致肝脏细胞功能损伤和凋亡，引起线粒体氧化应激的恶性循环，从而产生NAFLD相关肝脏损伤的临床表现。

本研究采用的香砂六君丸浓缩丸包含党参、白术（炒）、茯苓、半夏（制）、陈皮、甘草（蜜炙）、木香、砂仁、生姜、大枣，具有燥湿化痰、补脾益气的功效，主治食量不多，气虚痰多，腹胀便溏等的脾虚气弱的症状[13]。在给予NAFLD大鼠香砂六君子丸治疗后，治疗组大鼠血清TC和LDL-C水平明显降低，肝细胞脂肪变性减少，空泡化减轻，细胞结构趋于正常。与模型组大鼠比较，治疗组大鼠线粒体结构与功能的损伤减轻，mtDNA拷贝数与复合物I与复合物IV活性显著性升高，提示香砂六君丸可以减轻NAFLD大鼠氧化应激引起的线粒体受损程度，从而提高线粒体对氧自由基的防御能力[14]。本研究发现香砂六君丸对NAFLD导致的线粒体mtDNA拷贝数与线粒体复合物活性损伤起到一定的调节作用，但其具体作用机制还有待深入研究。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

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Effect of Xiangsha Liujunzi Pill on liver’s mitochondrial of rats with nonalcoholic fatty liver disease

LOU Linjie1, YOU Yanting2, MA Ke2, CHEN Zewei2, SUN Xiaomin2, ZHOU Lin3.
1.Department of Traditional Chinese Medicine, the First Aff i liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou, 510515; 3.Department of Endocrinology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, 510515

Objective： To observe the effect of Xiangsha Liujunzi Pill on liver’s mitochondrial in rats with nonalcoholic fatty liver disease. Methods： Under specific pathogen free (SPF) conditions, 24 male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into control group, high fat and high cholesterol diet group (HFD)and Xiangsha Liujunzi Pill (1.35 g·kg-1·d-1) treatment group. After 12 weeks, all rats were executed to get liver samples. Blood paramaters were analyzed by automatic biochemical. The copy number of mitochondrial DNA(mtDNA) and the activity of mitochondrial respiratory chain complex I, IV in liver samples was analysized with RT-PCR and UV spectrophotometer respectively. Results： Compared with control group, the hepatic wet weight and mass index (hepatic wet weight/body mass) increased signif i cantly, levels of total cholesterol (TC) and lowdensity lipoprotein cholesterol (LDL-C) in serum were signif i cantly increased, and the copy number of mtDNA and the activity of complex I, IV expression were signif i cantly decreased in HFD group. Compared with HFD group, the liver wet weight and quality index of rats were signif i cantly reduced, levels of TC and LDL-C in serum were signif i cantly increased, and the copy number of mtDNA and the activity of complex I, IV expression were signif i cantly increased in Xiangsha Liujunzi Pill treatment group. The HE staining of liver showed that the livers sections of HFD group were abundant of macrovesicular fat droplets in hepatocytes and large quantities ofballooned hepatocytes in centrilobular parenchyma with in fi ltration of in fl ammatory cells and fi brosis. The livers sections of HFD group showed that the macrovesicular fat droplets decreased and the nucleus consolidation was reduced. Conclusion： Xiangsha Liujunzi Pill would has effect on nonalcoholic fatty liver disease. Xiangsha Liujunzi Pill can regulate the disordered mitochondrial respiratory chain complex in nonalcoholic fatty liver disease.

nonalcoholic fatty liver disease; Xiangsha Liujunzi Pill; mitochondrial resporatory chain complex;DNA, mitochondrial

R2-031

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.11.004

2016-10-22

国家自然科学基金资助项目（81202622）；广东省自然科学基金资助项目（2014A030313292）；广州市产学研专项（2014Y2-00504）。

娄林洁（1985-），女，浙江温州人，住院医师，硕士。

周琳，副主任医师，Email：zlecho@163.com。

贾建敏）