生防烟管菌对植物抗病性相关酶活性及叶绿素含量的影响

张红楠，张旭辉，吴 頔*

(西南大学 a园艺园林学院， b资源环境学院，重庆 北碚 400716)

生防烟管菌对植物抗病性相关酶活性及叶绿素含量的影响

张红楠a，张旭辉b，吴 頔a*

(西南大学 a园艺园林学院， b资源环境学院，重庆 北碚 400716)

探究生防烟管菌对植株抗病性相关酶活性及叶绿素含量的影响，明确烟管菌对植株抗病性的诱导作用，以期为植物真菌病害的生物防治提供新思路。以油菜和黄瓜为盆栽植物，分别接种油菜核盘菌和蔓枯病菌，试验共设4组处理：只接种病原真菌(CK病)、无菌水处理(CK水)、同时接种病原真菌和烟管菌菌液(CT1)、接种病原真菌并喷施10 mL 80 μg·mL-1多菌灵(CT2)。处理两周后收获植株，采用分光光度法测定植株抗病性相关酶活性(SOD、CAT和POD)以及叶绿素含量。结果表明，生防烟管菌处理病害侵染的植株后，油菜和黄瓜叶片SOD、CAT和POD活性较CK水和CK病均有所提高，其中，油菜植株中CT1的SOD活性达到64.0 U·g-1，分别是CK水、CK病和CT1的1.8、1.6和1.1倍，黄瓜植株中CT2的SOD活性则分别是CK水、CK病和CT2的1.1、1.1和1.0倍； 而油菜植株中CT1的CAT活性分别高出CK水、CK病和CT2的25.4%、11.9%和 340%，黄瓜植株中则分别为CK水、CK病和CT2的1.0、1.1和0.9倍；油菜植株中CT1 的POD活性最高，但仅为最低活性的CT2的1.1倍，而黄瓜植株中CK病的POD活性则分别是CK水、CT1和CT2的3.7、1.4和1.6倍。CT2处理的油菜叶绿素含量为3.1 mg·g-1，分别为CK病和CT2的1.2和1.1倍，但明显低于CK水，黄瓜植株中CT1的叶绿素含量达到2.4 mg·g-1，分别为CK水、CK病和CT1的1.1、2.5和1.3倍。因此，烟管菌作为生防菌能够诱导植株抗病性相关酶活性及叶绿素含量提高，诱导植物产生抗病性，在生物防治的应用中具有广阔前景。

烟管菌； 生物防治； 防御酶活性； 叶绿素含量； 诱导作用

由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的菌核病[1]和由蔓枯病菌(Didymellabryoniae)引起的蔓枯病[2]是农业生产上两种最普遍的真菌病害，可侵害多种植物，极大地影响作物的产量和品质，给农业生产和发展带来了巨大障碍[3-4]。由于目前尚无理想的商品化抗病品种[5-6]，因此对这两种植物病害的防治主要为化学农药防治[7-9]，但是长期使用杀菌剂，很容易产生抗药性，同时引起的药物残留和环境污染等问题已经不符合农业健康可持续发展的要求[10]。生物防治因其高效持久、环境友好和无药物残留等特点已成为当前国内外防治植物病害的研究热点，并将逐渐成为植物病害防治的主流方向[11]。关于油菜菌核病和西瓜蔓枯病的生防研究层出不穷。杨蕊等[12]研究发现，盾壳霉(Coniothyriumminitans)Chy-1对核盘菌的抑菌率达82.5%。而夏龙荪等[13]报道球孢白僵菌(Beauveriabassiana)对油菜核盘菌同样具有较好的抑制效果。Martínez等[14]研究表明，哈茨木霉(Trichodermaharzianum)和棘孢木霉(Trichodermaasperellum)都能够显著抑制蔓枯病菌，并有田间应用价值。

关于生防机制的研究大多集中在生防菌与病原菌之间的相互作用，而忽视了寄主植物的参与，事实上一些非生物因子和生物因子都可以诱导植物抗病性的提高。有研究表明生防菌可以诱导植物抗病相关防御酶产生变化，进而增强植物抗病能力[15-16]。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)是植物体内三大防御酶，植物对病害及逆境的抗性均与之息息相关[17]，叶绿素则是植物进行光合作用而获得有机营养物的基础，但当病原菌侵入植物后，往往能够导致叶绿体的解体，发病严重的话会使叶绿素合成受阻，出现叶片褪绿、黄化或花叶等症状。因此，叶绿素含量的高低往往能够客观地反映植物抗病性的强弱[18]。近年来，很多学者对施用生防菌后植物某些酶类及其代谢产物的变化与植物抗病性关系进行了广泛的研究。金娜等[19]报道红灰链霉菌HDZ-9-47可以提高番茄根部SOD和POD活性，进而诱导植株产生抗病性。刘朝辉等[20]通过对茄子苗期接种哈茨木霉T23和黄萎病菌后，发现茄子叶片内与抗病性相关的SOD、POD和PPO的活性均有增加，证明了哈茨木霉T23能诱导茄子植株体内产生植保素等物质参与抵御黄萎病。梁艳琼等[21]以POD、SOD和CAT等5种防御酶为植物抗病性反应指标，阐明了生防菌TB2对甘蔗抗赤腐病的诱导作用。贾瑞莲等[22]以自主分离的寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)为生防菌株，研究其对番茄抗灰霉病的诱导作用，发现寡雄腐霉能够增强番茄叶片抗病性相关的CAT和POD活性，而且提高了番茄中叶绿素含量，诱导植株产生抗病性反应。

国内外关于利用烟管菌(Bjerkanderaadusta)进行生物防治的研究寥寥无几[23-24]。而本课题组在前期所分离、鉴定的烟管菌(B.adusta)已被证明对多种植物病原真菌引起的病害有较好防治效果，特别是对西瓜蔓枯病具有明显抑制效果[25]。但是目前利用烟管菌防治真菌病害的生理变化效果未见报道，生防烟管菌是否能够诱导植株产生抗病性而降低病害也尚不清楚。为此，本研究选择植物内SOD、CAT、POD活性和叶绿素含量作为抗病性反应指标，研究了生防作用下植株抗病相关生理机制的变化规律，以明确烟管菌对抗病性反应的诱导机制，为合理利用该生防菌进行生物防治奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生防菌株

生防烟管菌(Bjerkanderaadusta)，本课题组于重庆北碚国家紫色土肥力与肥料效益监测基地(106°24′33″E， 29°48′36″N)分离、筛选得到。

1.1.2 病原真菌

油菜核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)和西瓜蔓枯病菌(Didymellabryoniae)，均由西南大学植物生态病理研究所惠赠。

1.1.3 培养基

PDA培养基(去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然)；PD培养液(去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然)；发酵培养基(麦芽糖2%，NH4Cl 1%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl20.1%，KH2PO40.2%，pH值 7.4)；生长培养基(麦芽糖2%，KNO31%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl20.1%，KH2PO40.2%，琼脂1.5%，pH 7.0)。

1.1.4 其他材料

油菜(BrassicacampestrisL.)种子品种为德杂油9号，四川绵阳特研种业有限公司；黄瓜(CucumissativusL.)种子品种为春夏秋王，山东省宁阳县阳光种子有限公司；50%多菌灵可湿粉剂，威海韩孚生化药业有限公司；植物栽培土为西南大学二号试验田紫色土，将其过筛后高压蒸汽灭菌2 h。盆栽试验在西南大学1号温室进行，温度为28～40 ℃，相对湿度为45%～70%。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化与培养

将低温保存的烟管菌菌株转接在生长培养基上，菌丝面朝下使其紧密接触培养基，在32 ℃恒温培养箱中活化，而油菜核盘菌和西瓜蔓枯病菌转接至PDA培养基上，于28 ℃恒温培养箱中活化。然后用直径5 mm的无菌打孔器打取活化的烟管菌菌饼5块于盛有30%(V/V)发酵培养基的三角瓶中，于30 ℃、180 r·min-1摇床培养7 d，得到烟管菌菌体及其代谢液；以同样方法将油菜核盘菌菌饼及西瓜蔓枯病菌饼置于盛有300 mL无菌PD培养液中，与烟管菌菌株同样条件下进行摇床振荡培养，得到病原菌菌体及其代谢液。

1.2.2 植株育苗及温室培养

将油菜种子和黄瓜种子先用10%H2O2消毒3～5 min，再用55 ℃左右的温水浸种10 min，转移至铺有湿润纱布的无菌器皿中于30 ℃催芽，待发芽后播种在装有121 ℃高压灭菌栽培土的花盆(直径19 cm×13 cm)中，然后置于25 ℃，相对湿度80%的温室内培养至长出子叶。

1.2.3 烟管菌与病原真菌处理

待1.2.2节培养的植株缓苗20 d后，选择长势基本一致的植株进行试验处理。采用牙签接种法[26]在油菜植株和黄瓜植株第3、4片老叶及距根20 cm处的茎部分别进行接菌处理，试验设计4组处理，CK病，只接病原真菌；CK水，只接无菌水；CT1，同时接种病原真菌和烟管菌菌株；CT2，接种病原真菌并喷施10 mL 80 μg·mL-1多菌灵；每个处理组各15株。

1.2.4 植株样品粗酶液的制备及酶活性测定

参照Chen等[15]的方法提取植物组织内防御酶酶液。称取同一叶位处的叶片0.5 g，将其剪碎后于预冷的研钵中，加1 mL预冷的磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，再加缓冲液使缓冲液的终体积为5 mL，转移至10 mL离心管后于4 ℃、10 000 r·min-1下离心20 min，上清液即为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的粗酶液。超氧化物歧化酶(SOD)的活性测定参照Sudisha等[27]的方法，过氧化氢酶(CAT)的活性测定参照杨兰芳等[28]的方法，过氧化物酶(POD)的活性测定参照李忠光等[29]的方法。

1.2.5 植株样品叶绿素含量测定

叶绿素提取及含量测定参照昌梦雨等[30]的方法。称取剪碎的新鲜样品0.2 g于干净研钵中，加入少量石英砂及3 mL 95%乙醇，研磨成浆，再加乙醇10 mL，继续研磨至组织变白，静置3～5 min。将研钵中的提取液过滤至25 mL棕色容量瓶中，最后用乙醇定容，摇匀。以95%乙醇为空白，在波长665 nm、649 nm下测定吸光值，计算不同样品叶绿素含量。

1.3 数据处理与统计分析

所有的数据采用Excel 2007进行统计处理，试验均设3次重复。利用SPSS 18.0统计软件进行结果分析，Duncan’s多重比较进行显著性差异检验(P<0.05)；图表采用Excel 2007绘制。

2 结果与分析

2.1 对植物SOD活性的影响

由图1可见，各处理的油菜SOD活性依次增加，但增幅不大，CT2的SOD活性最高，达到64.0 U·g-1，分别是CK水、CK病和CT1的1.8、1.6和1.1倍，表明油菜受到病害侵染后植株的SOD活性增加，而施用烟管菌和多菌灵进行处理又进一步增强了SOD活性，从而增强植物的抗病能力。黄瓜SOD活性整体高于油菜植株，其中CT1的SOD活性最高，达到219 U·g-1，是最低处理CK病的1.1倍，但各处理之间均未达到显著差异(P>0.05)。

同一植株不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。同图2、图3、图4图1 不同处理对植物SOD活性的影响

2.2 对植物CAT活性的影响

如图2所示，CT1的油菜CAT活性最高，达到21.5 U·g-1·min-1，分别为CK水、CK病、CT2的1.3、1.1和4.4倍，仅与CT2之间差异达到显著水平(P<0.05)。黄瓜中，CT2的CAT活性最高，达到20.4 U·g-1·min-1，CT1次之，为18.3 U·g-1·min-1，其CAT活性分别为CK水和CK病的1.0和1.1倍，各处理间均无显著差异。

图2 不同处理对植物CAT活性的影响

2.3 对植物POD活性的影响

如图3所示，油菜中，各处理间POD活性基本相等，均在1 000 U·g-1·min-1左右，而黄瓜中，各处理的POD活性相差比较明显。具体来看，油菜中，CT1的POD活性最高，达到1 097 U·g-1·min-1，高出CT2 8.3%，CK水和CK病的POD活性介于CT1和CT2之间，各处理间并未达到显著差异水平。黄瓜中，CK病的POD活性最高，达到1 876 U·g-1·min-1，分别是CK水、CT1和CT2的3.7、1.4和1.6倍，均已达到显著差异水平，CT1的POD活性达到1 359 U·g-1·min-1，是CT2的1.2倍，差异达到显著水平。

图3 不同处理对植物POD活性的影响

2.4 对植物叶绿素含量的影响

图4显示，油菜植物中，CK水的叶绿素含量最高，达到3.5 mg·g-1，高出最低叶绿素含量(CK病)的40%，2个处理间存在显著差异，CT1处理的叶绿素含量为3.1 mg·g-1，略高于CT2，表现出CK水>CT1>CT2>CK病。黄瓜中，叶绿素含量整体低于油菜，其中CT2的叶绿素含量最高，达到2.4 mg·g-1，分别为CK水、CK病和CT1的1.1、2.5和1.3倍，分别达到显著差异水平。

图4 不同处理对植物叶绿素含量的影响

3 小结与讨论

本研究通过温室盆栽试验探究了烟管菌对油菜菌核病及西瓜蔓枯病的生防作用，其处理后的油菜和黄瓜植株的抗病性相关酶活性均有不同程度地提高，叶绿素含量也均有增加，揭示了盆栽接种生防烟管菌对增强植株抗病性具有良好的促进作用，说明该菌株在生物防治中具有开发前景和应用价值。

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2017-07-18

科技部农业科技成果转化资金(2013GB2F100396)；中国博士后科学基金(2016M592621)；西南大学基本科研业务费专项资金项目(XDJK2016C185)

张红楠(1992—)，女，河南安阳人，硕士在读，研究方向为植物病理与病害防治，E-mail：hongnanzhang@163.com。

吴 頔，重庆人，博士后在读，E-mail：wudisuper610@126.com。

文献著录格式：张红楠，张旭辉，吴頔. 生防烟管菌对植物抗病性相关酶活性及叶绿素含量的影响[J].浙江农业科学，2017，58(12)：2226-2230，2234.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171245

S436

A

0528-9017(2017)12-2226-05

张瑞麟)