牛结核高污染场的监测与净化

张洪军 李秀慧 路广计 陈瑞兰 王会敏王佩绮 尹利利 刘国臣 张秀丽 赵晓光 曹 瑞

（1.河北省围场县动物疫病预防控制中心，河北围场 068450；2.河北省围场县动物疫病预防控制中心，河北石家庄 050000；3.青岛瑞尔生物技术有限公司，山东青岛 266100）

牛结核高污染场的监测与净化

张洪军1李秀慧1路广计2陈瑞兰1王会敏1王佩绮1尹利利1刘国臣1张秀丽1赵晓光1曹 瑞3

（1.河北省围场县动物疫病预防控制中心，河北围场 068450；2.河北省围场县动物疫病预防控制中心，河北石家庄 050000；3.青岛瑞尔生物技术有限公司，山东青岛 266100）

比较不同的试验方法，寻找适合高污染场奶牛结核病的检测及净化方法。方法：同时采用单纯牛结核菌素（PPD）皮内变态反应试验（TST）、比较皮内变态反应试验（SICTT）、牛结核病ELISA γ-干扰素检测试验（IFN-γ-ELISA）、牛结核病抗体ELISA检测方法和牛结核病抗体免疫胶体金方法对某结核病污染奶牛场30头不同年龄牛进行结核病检测，评价不同方法的优缺点，探讨最佳的检测方案及净化方法。经综合判定牛型结核阳性20头（其中5头为牛型、禽型双阳性）、阴性10头（其中1头为禽型阳性），牛型结核阳性率66.67%、禽型结核阳性率63.33%、二者混合感染率为63.33%。试验表明，仅靠一种活体检测方法难以做出牛结核病准确诊断。因此，可采用TST初筛，阳性和可疑牛用IFN-γ-ELISA复检以排除部分假阳性，对于早期感染牛场可直接采用IFN-γ-ELISA方法检测并按照相应的方案进行净化。

牛结核病 检测 净化

牛结核病是由牛分枝杆菌引起的人兽共患传染病，国际动物卫生组织（OIE）列为必须报告的B类动物疫病，在世界各地均有发生，我国列为二类动物疫病，也是常见的多发病[1]。由于牛结核病是一种慢性进行性传染病，在感染早中期肉眼很难发现可见症状，即使感染晚期表现出症状也不特异，难以通过临床观察做出准确诊断。只能通过剖检和细菌培养才能确诊，但此法不能用于活畜[2]。目前活畜检测最理想、有效且广泛应用的方法主要有牛结核菌素（PPD）皮内变态反应试验（TST）、比较皮内变态试验（SICTT）和牛γ-干扰素酶联免疫吸附试验（IFN-γ-ELISA）。

TST是我国国家标准规定的唯一方法，应用最为广泛。OIE将SICTT列为TST的替代试验或平行试验，澳大利亚、新西兰和欧美等许多国家批准为正式试验[3，4]。

本试验采用上述方法对规模化奶牛场进行结核病检测，对实验结果进行综合分析，为实际生产提供准确的诊断依据，减少因误诊造成的扑杀损失，同时为净化规模化奶牛场群提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

牛型PPD（批号201502）购自中国兽医药品监察所，100头/瓶，禽型PPD（批号200603）购自中国兽医药品监察所，100头/瓶，牛结核病ELISA γ-干扰素检测试剂盒（批号：R201603-001），青岛瑞尔生物技术有限公司生产；牛分枝杆菌ELISA抗体检测试剂盒（批号：160804），购自武汉科前动物生物制品有限责任公司；牛结核病抗体胶体金检测试剂盒（批号：2302DG006），购自广州悦洋生物技术有限公司，副结核ELISA抗体检测试剂盒（批号：6332501301），购自prionics公司。

1.1.2 试验动物

某奶牛场的30头奶牛，其中，泌乳牛、育成牛和犊牛各10头。

1.1.3 器材

剪毛剪、0.5 mL注射器、游标卡尺、酶标仪（包含450nm和620-650nm滤光片）、CO2培养箱、24孔细胞培养板、肝素采血管、移液器及吸头等。

1.2 方法

1.2.1 单纯皮内变态反应试验（TST）

参照《动物结核病诊断技术》（GB/T18645-2002）进行试验

1.2.2 比较皮内变态反应试验（SICTT）

采用牛PPD和禽PPD，统一在牛颈部左侧分点皮内注射，两个注射点间隔12～15cm。牛型PPD皮厚差减去禽型PPD皮厚差的数值大于4 mm判为阳性；大于1 mm小于4 mm判为可疑；牛型PPD皮厚差小于等于禽型PPD皮厚差判为阴性。

1.2.3 IFN-γ-ELISA试验

无菌采集肝素抗凝全血，8 h内在实验室分成3份置于培养板孔内，分别用牛PPD、禽PPD和PBS刺激，置CO2培养箱37℃培养16～24h。收集上清，按牛结核病ELISA γ-干扰素检测试剂盒说明书进行操作。每孔加100μL待测样品和对照品于相应孔中，室温孵育1h。洗涤4次，每孔加100μL酶标抗体，室温孵育1h。洗涤4次，每孔加100μLTMB溶液，室温避光孵育10min。每孔加入50μL终止液，读取OD630值。按下列公式判定：当牛PPD刺激上清OD值—禽PPD刺激上清OD值≥0.1，且牛PPD刺激上清OD值—PBS刺激上清OD值≥0.1时，判为牛结核阳性；当牛PPD刺激上清OD值—禽PPD刺激上清OD值＜0.1或牛PPD刺激上清OD值—PBS刺激上清OD值＜0.1时，判为牛结核阴性。

1.2.4 牛结核抗体ELISA试验

按照牛分枝杆菌ELISA抗体检测试剂盒操作步骤进行并进行相应结果的判定。

1.2.5 牛结核抗体胶体金检测试验

用吸管滴一滴样品至检测孔，10min观察结果。检测线和对照线均显色判为阳性，对照线显色而检测线不显色为阴性，对照线不显色试验不成立。

1.2.6 试验结果对比分析

对比分析TST试验、SICTT试验、IFN-γ-ELISA试验、牛结核抗体ELISA试验和牛结核抗体胶体金试验。

2 结果

30头牛经TST、SICTT、IFN-γ-ELISA、抗体ELISA和抗体胶体金方法检测，其中TST试验20头阳性4头可疑，SICTT试验19头阳性4头可疑，IFN-γ-ELISA试验25头阳性，抗体ELISA试验均为阴性，抗体胶体金试验1头弱阳性。结果详见表2。

表2 不同检测方法检测结果

表3 不同试验方法检测结果

实验判定结果表明，试验牛群既有牛分枝杆菌感染，又有禽结核分枝杆菌感染，前者感染率为66.67%（20/30），后者感染率为63.33%（19/30），二者混合感染率为63.33%（19/30）。INF-γ感染率为83.33%（25/30），除胶体金抗体检测20#为阳性，其他均为阴性，见表3。由此判断此奶牛场是牛结核高污染的场。

3 讨论

目前我国及全球范围内运用最广泛的检测方法是TST，但是其检测结果受其他病原感染、药物、试剂质量及剂量、人为误差、个体差异等很多因素干扰[2]，会造成一定比例的假阳性、假阴性，从而降低其敏感性、特异性、准确性。本试验通过TST检测确认本场群63.33%感染了牛、禽结核分枝杆菌。TST检测方法成本较低，耗时相对较长，准确率较低，而且早期感染牛难以检出，60d内复检阳性率降低。特异性均低于SICCT、IFN-γ-ELISA。同时由于人为误差造成假阴性，致使其敏感性降低。

尽管抗体胶体金检测是最近出现的快速、简便的检测方法，但是通过本实验的结果可以看出通过抗体检测的方法检测的结果存在误差，产生25个假阴性，原因之一是患病个体免疫功能低下，抗体水平低，无法检测出来。再者可能是不同机体的免疫水平存在差异，患病个体处于临床感染初期，结核抗体的产生处于“窗口期”。而假阳性产生的原因可能是自然结核分枝杆菌感染后体内存在一定水平的抗体，因此抗体检测虽简洁快速但不适用。

4 建议

针对此类污染场，我们建议先按1.2.1的方法对规模化奶牛场存栏奶牛按100%进行检测初筛，初筛结束后将该奶牛场分为污染群、稳定控制群、净化群。

对于污染群按1.2.1及1.2.3的试验方法进行普检。确定的阳性个体进行扑杀销毁，按照 G/B16548执行，而阴性个体进入稳定控制群继续监测。

对于稳定控制群按1.2.1及1.2.3试验方法每隔2个月进行普检。确定的阳性个体进行扑杀销毁，按照GB16548 执行，阴性个体每两个月进行一次普检，连续监测2年，若无阳性出现，进入净化群。

成为净化群的规模奶牛场，以后每半年监测一次，场群100%监测。

[1] 何昭阳.牛结核病研究进展[J].预防兽医学进展，2001，3（4）：34-39.

[2] 路广记，曹瑞，张军，等.对奶牛结核病平行检测的不同方法[J].中国动物检疫，2014，31（12）：43-46.

[3] Rollins D M，Colwell R R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment[J].Appl Environ Microbiol，1986，（52）：531-538.

[4] Josefsen M H，Lofstrom C，Hansen T B，et al.Rapid quantification of viable Campylobacter bacteria on chicken carcasses，using real-time PCR and propidium monoazide treatment，as a tool for quantitative risk assessment[J].Appl Environ Microbiol，2010，（76）：5097-5104.