鄂西北地区慢性乙型肝炎患者HBV基因型与耐药突变的研究*

雷 青 孟忠吉

湖北医药学院附属太和医院感染科 (湖北 十堰， 442000)

鄂西北地区慢性乙型肝炎患者HBV基因型与耐药突变的研究*

雷 青 孟忠吉△

湖北医药学院附属太和医院感染科 (湖北 十堰， 442000)

目的：分析鄂西北地区慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)基因分型与耐药突变的分布及其临床特点。方法回顾性研究2011.1-2016.11太和医院感染科病房及门诊基因测序法和基因芯片法检测的324例慢性乙型肝炎患者的HBV基因型、常见核苷(酸)类似物(NAs)耐药突变位点、肝功能指标、HBV DNA定量及临床特点等，并分析其相关性。结果基因测序法检测238例，芯片法86例，其基因分型均以B型为主，基因芯片法中可以检测到少量D型及混合基因型。共132例患者检测出NAs 耐药，耐药突变位点以204位点最多见，B、C基因型耐药率及临床表现的差异无统计学意义，耐药位点整体分布存在差异，但NAs耐药分布一致，均以拉米夫定耐药为主。结论鄂西北地区慢性乙型肝炎患者的HBV基因分型以B型为主，C型次之，B、C基因型患者耐药突变位点的分布存在一定差异，但其耐药率、临床表现及NAs耐药分布差异无统计学意义。B型患者无NAs抗病毒治疗史患者NAs耐药率高于C型患者。

乙型肝炎；基因分型；耐药突变

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行，我国慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例[1]。抑制乙型肝炎病毒复制常用的药物主要包括核苷(酸)类似物(NAs)和干扰素[2]，NAs耐药突变是影响抗病毒疗效的重要影响因素。同时，HBV的基因分型与慢性乙型肝炎患者的抗病毒疗效及预后存在一定关联[3，4]。本研究拟回顾性研究太和医院2011-2016年收治的慢性乙型肝炎患者HBV基因分型、NAs耐药突变及其临床特点，分析三者的相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料 回顾性分析太和医院感染科2011年1月-2016年11月门诊及住院的有病毒学突破的慢性乙型肝炎患者的HBV基因分型、耐药突变位点特征及临床资料，共纳入病例324例，其中男258例(79.63%)，女66例(20.37%)，平均年龄40.23±12.02岁。其中，基因测序法检测238例，基因芯片法检测86例。慢性乙型肝炎及病毒学突破的诊断符合我国2015年《慢性乙型肝炎防治指南》[2]，本研究符合伦理学要求。

1.2 检测方法 2011年-2013年11月 HBV患者基因分型及耐药突变位点检测采用PCR直接测序法，2013年11月-2016年11月变更检测方法，换为基因芯片法检测，均由太和医院生物医学研究所检测，检测所需的TaqDNA聚合酶、DNA Mark均购自大宝生物工程有限公司，PCR循环仪为美国Bio-Rad公司产品，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)和白蛋白(Alb)等肝功能指标及HBV DNA定量均由太和医院检验科检测，所有数据均从临床电子病历系统及检验数据库中调取。

1.3 耐药突变位点 本研究中主要检测了NAs常见的10个耐药突变位点：173L、180M、181V、184AGIS、194TM、204VIS、207MIL、213T、236T、237H等。

2 结果

2.1 32例患者HBV基因型和耐药情况 324例患者中HBV基因分型B型191例(58.95%)，C型112例(34.57%)，BC混合型8例(2.47%)，CD混合型7例(2.16%)，D型、BD型、BCD型各2例(各占0.62%)。共132例出现耐药，占40.74%，其中B基因型耐药77例(77/191，40.31%)，C型耐药49例(49/112，43.75%)，B、C基因型患者耐药率的差异无统计学意义(X2=0.328，P=0.567)。出现耐药的患者中25例(25/132，18.94%)未使用过NAs抗病毒治疗，其中B型17例(17/77，22.08%)，C型4例(4/49，8.16%)，其他混合型共4例，B、C基因型患者天然耐药率差异有统计学意义(X2=4.174，P=0.041)，见表1。

表1 患者基因型及NAs耐药情况 [n(%)]

与B基因型比较，*P<0.05

2.2 B、C基因型NAs耐药患者的临床特点 B、C型患者的ALT、AST、TBil、Alb水平和HBV DNA定量等临床指标的比较显示差异均无统计学意义见表2。其首发临床症状均以乏力为主，其次为纳差、尿黄、腹胀、恶心、腹痛等，不同基因型患者的临床表现一致(χ2=3.174，P=0.673)，见表3。

表2 B、C基因型NAs耐药患者的临床指标比较

表3 B、C基因型NAs耐药患者首发临床症状比较 [n(%)]

2.3 耐药位点分布 132例NAs耐药患者的耐药突变位点检测显示：204位点突变72例(72/132, 54.55%，其中204I 53例，占73.61%)，180位点42例(31.82%)，236位点28例(21.21%)，181位点15例(14.56%)，204位点突变率最高，且以204I为主。

2.4 基因分型与耐药突变位点的关系 B、C基因型各位点突变分别为204位点突变38例(49.35%)、34例(69.39%)，180位点20例(25.97%)、22例(44.9%)，181位点突变分别为6例(7.79%)、9例(18.37%)，236位点突变分别为24例(31.17%)、4例(8.16%)。此外，B基因型中还可见213位点突变5例、207位点突变4例，C基因型中检测出237H位点突变2例，与180M和204I联合出现。B、C基因型的耐药突变位点均以204位点最多见，但二者耐药位点的整体分布不全一致(χ2=23.469，P<0.0001)。

2.5 基因分型与核苷(酸)类似物耐药情况 B、C基因型患者对核苷酸类似物耐药以拉米夫定耐药最多，分别为46例(59.74%)、38例(77.55%)；其次为替比夫定，B、C型耐药分别是32例(41.56%)、21例(42.86%)；阿德福韦酯耐药分别为25例(32.47%)，9例(18.37%)；B、C型中各检出1例恩替卡韦耐药，分别占1.3%和2.04%。替比夫定耐药者均对拉米夫定耐药。B、C基因型患者对核苷酸类似物的耐药情况分布一致(χ2=6.549，P=0.088)。

3 讨论

根据HBV全基因组核苷酸序列同源性≥92%或S基因序列同源性≥96%，目前已发现A-J共10个HBV基因型[5]，不同地域基因型分布存在一定差异，我国HBV基因分型以B、C型最常见，亦可见少量A和D型，南方地区以B型为主，北方以C型为主，新疆等少数民族可见基因D型[6]。本研究中，先后采用基因测序和基因芯片两种方法检测HBV基因分型，因基因测序法仅能测出优势基因型，故仅检测出B型和C型，未能检测出混合基因型，检测结果与孟忠吉等[7]研究结果相吻合。随着检测方法的改进，后续采用基因芯片法检测基因分型，该技术可检测出混合基因型，因此，使用基因芯片法检测患者中B基因型所占比例明显降低，但两种方法检测结果均显示鄂西北地区HBV基因分型以B型为主，其次为C型，这与我国的基因型分布情况相一致。在本研究中还发现少量的D基因型，考虑与我市人口流动性较大相关。同时，本研究显示B、C基因型患者的NAs耐药率的差异无统计学意义，这也与孟忠吉等[7]的研究结果相一致。

有研究显示不同基因型的乙型肝炎患者的临床表现及预后存在一定差异[4，8]， C基因型较B型患者发展成肝癌的风险更大[9，10]。本研究中B、C基因型患者的ALT、AST、TBil、Alb水平及HBV DNA定量等临床指标及首发临床症状无显著差异，有待进一步对这些患者进行长期随访以分析评估不同基因型患者的远期预后的差异。

在本研究中共检测了10个常见NAs耐药位点，以204位点突变最为多见，其次依次为180、236和181位点，207、213等其他位点耐药罕见。B、C基因型均以204位点耐药突变最多，236、180位点的突变情况存在差异。但B、C基因型患者的NAs耐药情况分布一致，均以拉米夫定耐药最多见，其次为替比夫定、阿德福韦酯，恩替卡韦耐药最少。这与NAs耐药位点的分布有关，拉米夫定的耐药位点以204为主，辅以180位点突变，阿德福韦酯耐药突变位点为236和181位点，替比夫定耐药位点为204I的突变，而B、C基因型均以204位点突变为主，尤其是204I，其耐药突变位点的差异主要存在于180和236位点之间，因此，虽然B、C基因型患者的NAs耐药突变位点的分布存在一定差异，但二者对NAs的耐药情况分布一致，替比夫定耐药者均对拉米夫定耐药。本研究中，拉米夫定耐药最为多见，一方面，这与拉米夫定上市早，价格相对低廉，使用率高有关；另一方面，也因为拉米夫定的主要耐药基因YMDD变异与HBV DNA聚合酶的基因突变有关。

此外，本研究中B、C基因型NAs耐药者中均存在无NAs抗病毒用药史患者，且B型患者中无NAs用药史但出现NAs耐药的患者比例高于C型，差异有统计学意义，表明部分患者存在天然核苷酸类似物耐药情况，且在B型中更多见。但B、C基因型患者的总体耐药率无统计学差异，是否能说明在使用NAs后B型患者发生NAs耐药的几率较C型的更小，还需大样本、远期的随访进一步证实。

总之，鄂西北地区慢性乙型肝炎患者HBV基因分型以B型为主，C型多见，亦可见少许D型及混合型，NAs耐药突变位点以204位点突变最常见，尤其是204I，以拉米夫定耐药为主，B、C两种基因型患者的临床表现无显著差异，核苷酸类似物耐药情况分布一致，但其耐药突变位点分布存在差异，且B、C基因型无NAs抗病毒治疗史患者均存在天然NAs耐药现象，B型的发生率更高，有NAs抗病毒治疗史者B型较C型耐药率更低，其远期预后的差异有待进一步研究。在使用NAs抗病毒的基础上检测基因分型及NAs耐药情况对乙型肝炎的精准治疗具有一定的指导意义。

[1] Lu F M, Zhuang H.Management of hepatitis B in China[J].Chin Med J (Engl), 2009,122(1):3-4.

[2] 中华医学会肝病学分会, 中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)[J].中华传染病杂志, 2015,33(11):641-662.

[3] Lin C L, Kao J H.Hepatitis B virus genotypes and variants[J].Cold Spring Harb Perspect Med, 2015,5(5):a21436.

[4] Croagh C M, Desmond P V, Bell S J.Genotypes and viral variants in chronic hepatitis B: A review of epidemiology and clinical relevance[J].World J Hepatol, 2015,7(3):289-303.

[5] Tian Q, Jia J. Hepatitis B virus genotypes: epidemiological and clinical relevance in Asia[J]. Hepatol Int, 2016,10(6):854-860.

[6] Zeng G, Wang Z, Wen S,etal. Geographic distribution, virologic and clinical characteristics of hepatitis B virus genotypes in China[J]. J Viral Hepat, 2005,12(6):609-617.

[7] 孟忠吉, 李新宇, 张永红, 等. 核苷(酸)类药物治疗过程中发生病毒学突破的慢性乙型肝炎患者152例耐药分析[J]. 中华临床感染病杂志, 2013,6(4):234-236.

[8] Kramvis A. Genotypes and genetic variability of hepatitis B virus[J]. Intervirology, 2014,57(3-4):141-150.

[9] Wen J, Song C, Jiang D,etal. Hepatitis B virus genotype, mutations, human leukocyte antigen polymorphisms and their interactions in hepatocellular carcinoma: a multi-centre case-control study[J]. Sci Rep, 2015，21(5)：164-169.

[10] Sunbul M. Hepatitis B virus genotypes: global distribution and clinical importance[J].World J Gastroenterol, 2014,20(18):5427-5434.

StudyofHBVgenotypesanddrugresistancemutationsinpatientswithchronichepatitisBinnorthwestofHubeiProvince

LEIQing,MENGZhong-jiΔ.DepartmentofInfectiousDiseases,TaiheHospital,HubeiUniversityofMedicine(ShiyanHubei, 442000)China

Objective:To investigate the distribution and clinical characteristics of hepatitis B virus (HBV) genotypes and drug resistance mutations in patients with chronic HBV infection in northwest of Hubei Province.MethodsFrom Jan 2011 to Nov 2016,a total of 324 patients with Hepatitis B who were admitted to the department of infectious diseases of Taihe Hospital, Hubei University of Medicine

HBV genotyping and drug resistance mutations analysis by gene sequencing or gene chipassay.HBV genotypes, common mutation sitesrelated tonucleoside (acid) analogues (NAs), liver function index, HBV DNA viral loads and clinical characteristics of patients were extracted from clinical databases of Taihe Hospital, Hubei University of Medicine.The relationships among these parameters were statistically analyzed.ResultsHBV genotypes of 238 samples were detected by gene sequencing, and the other 86 cases by gene chip assay.Genotype B was the most common genotype, and a few of type D and mixed genotypes could be detected by gene chip assay.A total of 132 patients were found to have NAs related resistant mutant, and the most common mutation was M204I/V.There were no significant difference between genotype B and C in the rate of NAs related resistance and clinical manifestations.The profiles of the NAs-related mutations were different, while the distribution of NAs-related resistance were consistent, with lamivudine resistance primarily.ConclusionGenotype B was the most common HBV genotype in northwest of Hubei province, followed by genotype C.There were some differences between the genotype B and C in the distribution of NAs-related resistant mutation sites, but nostatistical difference was found in the rate of NAs-related resistant, clinical manifestations, or the distribution of NAs-related resistance.NAs-related resistance rate in patients without NAs antiviral treatment history was much higher in genotype B than that ingenotype C patients.

Hepatitis B; genotype; drug resistant mutation

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.04.003

湖北省科技厅自然科学基金(No.2014CFB645)，湖北省教育厅重大项目(No.Z20102101)；△通信作者，E-mail:zhongjimeng@163.com

，2017-03-22 编辑：程良斌)

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