尿道下裂患儿染色体及核型分析

祖建成 雍 江 胡建军 刘 宇 赵夭望 何 军

尿道下裂患儿染色体及核型分析

祖建成 雍 江 胡建军 刘 宇 赵夭望 何 军

目的通过对尿道下裂患儿染色体核型分析和SRY基因检测，初步明确染色体核型、SRY基因缺失情况和尿道下裂之间的关系。方法采用染色体核型Leica CytoVision®自动细胞遗传学分析系统进行染色体核型分析。采用PCR扩增琼脂糖凝胶电泳方法对SRY基因进行检测。结果137例尿道下裂患儿中，检测出染色体异常 10例（7．29%），其中Ⅰ型 2例（2／46，4．3%），Ⅱ型 3例（3／41，7．3%），Ⅲ型2例（2／26，7．6%），Ⅳ型 3例（3／24，12．5%），1例患儿 SRY检测阴性，染色体检测 45，XY，－21［10］／46，XY，r（21）［5］／46，XY，r（21；21）［13］，行双侧睾丸活检，双侧活检均有睾丸组织和卵巢组织，为DSD（disorders of sex development），其余病例未发现有SRY异常。结论染色体和核型改变是尿道下裂形成的主要原因之一，已确定可引起尿道下裂的染色体畸变有十余种，对于外生殖器分化模糊，如伴尿道下裂、阴蒂肥大呈阴茎样，根据生殖器外观常难以正确决定性别的患者，通过性染色体检查有助于做出明确诊断，并根据染色体检查结果和临床其它检查，明确是否DSD。

尿道下裂；染色体；核型分析

男性外生殖器发育是一个复杂过程，始于Y染色体的遗传启动，同时与决定细胞分化、激素信号传导、酶活性、组织重塑所需的性别决定基因（sexdetermining region on Y chromosome，SRY）及其蛋白产物－睾丸决定因子（testis determination factor，TDF）相关。染色体和核型改变是尿道下裂形成的原因，目前已确定可引起尿道下裂的染色体畸变有十余种，相关的染色体有 1、4、6、8、11、13、19、20、21、X、Y等十余条［1］。对于外生殖器分化模糊，如尿道下裂，阴蒂肥大呈阴茎样，生殖器外观常难以正确决定性别的患者，通过性染色体的检查有助于做出DSD诊断。本研究通过对尿道下裂患儿进行染色体核型分析和SRY基因检测，明确染色体核型、SRY基因缺失情况与尿道下裂之间的关系，并对是否DSD进行明确诊断。

材料与方法

一、研究对象

收集2012年1月至2013年4月本院收治的尿道下裂患儿137人，年龄最大13岁，最小的2．2岁，平均年龄4．6岁。按黄澄如《实用小儿泌尿外科学》分型标准［2］：Ⅰ型（阴茎头型、冠状沟型）46例，Ⅱ型（阴茎型）41例，Ⅲ型（阴茎根部和阴茎阴囊型）26例，Ⅳ型（阴囊型、会阴型）24例。

二、方法

1．荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）：收集尿道下裂患儿新鲜血液标本，进行染色体核型检测：将DNA探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子耦联的单克隆抗体与探针分子特异性结合，检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析，判断单个碱基突变［3］。

2．SRY检测：提取患儿DNA，并将提取物经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测为大于50 kb的人总DNA，采用 PCR技术对此进行 SRY基因检测［4］。

三、统计学处理

以SPSS17．0软件进行统计学分析，计数资料用阳性例数或阳性率表示，尿道下裂各组之间的比较用R×C表χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

137例尿道下裂患儿中，染色体异常10例（7．29%），其中1例患儿SRY（－），染色体核型45，XY，－21［10］／46，XY，r（21）［5］／46，XY，r（21；21）［13］，睾丸活检提示为 DSD，其余均为 SRY（＋），见表1。染色体核型改变见于Ⅰ型2例（2／46，4．3%），Ⅱ型 3例（3／41，7．3%），Ⅲ型 2例（2／26，7．6%），Ⅳ型3例（3／24，12．5%），见表2。

表1 尿道下裂染色体核型改变情况Table 1 Chromosomal and karyotypic changes of hypospadias

表2 不同类型尿道下裂染色体核型改变情况（n）Table 2 Chromosomal and karyotypic changes in different types of hypospadias（n）

讨 论

种族繁衍延续的物质基础是性别决定和分化。生物体内染色体（主要是性染色体）的完整性决定性别，染色体畸变和尿道下裂存在一定的相关性［1］。我们的研究表明尿道下裂患儿染色体畸变发生率不高。夏爱丽等［5］研究表明：大Y染色体核型可引起尿道下裂，Y染色体微结构变化对生育有影响。沈婉英［6］报告大Y染色体在人群中占13．81%。现知Y染色体长臂（Yq）远端的2／3为结构异色质，是Y染色体发生长度变化的最常见部位。但长度变化的病因尚未清楚，有人认为与易位、缺失、复制等有关，也有人认为是染色质中DNA重复过度所致。随着辅助生殖技术迅速发展和荧光原位杂交技术等新技术的应用，染色体的诊断水平提高，异常检出率随之增加［7，8］。我们的研究发现，尿道下裂患儿染色体核型改变中存在大Y的改变，其突变频率并不很高（1／137），说明大Y染色体可能是尿道下裂发病的风险因素。

性器官发育过程还需要有基因和激素的共同作用，最终决定或形成睾丸（雄性）或卵巢（雌性）。哺乳动物性别决定中SRY起关键作用，Yp11．3是SRY定位点，其存在一个外显子，无内含子，编码一种DNA结合蛋白，以转录因子形式存在于睾丸Sertoli细胞核中。该蛋白被分为3个区域，其中间的约80个氨基酸残基称为HMG box（highmobility group box，HMG box），是主要的功能域。HMG box能特异性识别并结合核心序列AACAAAG，并能使与之结合的DNA弯曲成某一角度。当编码HMG box基因发生突变时，SRY蛋白结合DNA的活性将会改变。蛋白N端的丝氨酸残基磷酸化后可增强与DNA结合活性，HMG box两端还携带有两个独立的核定位信号［9］。SRY蛋白产物睾丸决定因子（TDF），启动睾丸分化，抑制睾丸发育负调节，SRY突变将导致XY性逆转等性别异常的形成和发育［10］。

Harley VR等［11］研究报道4例XY女性反转病人，发现SRY的信号位点处均发生了错义突变。研究表明突变的SRY蛋白仅有部分定位在胞质，而野生型蛋白则限制在核内。每个信号都独立引导一种载体蛋白进行核运输，任何一个发生突变都会影响核内浓集的程度和效率。人类性腺嵴形成于受精后33 d左右，第41天SRY能在XY胚胎中检测，第44天高峰时可辨认睾丸索。第52天Sertoli细胞包围生殖细胞，并在Sertoli细胞核中持续低水平表达SRY［12］。这与其在性腺分化早期睾丸决定因子的作用相一致，SRY突变与性反转患者有关。DNA序列分析显示大多数XX男性反转患者中存在SRY，而仅有大约15%的XY女性患者中发现SRY的点突变或缺失。这一结论支持SRY是睾丸决定因子，同时也表明除SRY外还存在其他的性别决定基因的突变［12］。几乎所有携带SRY突变的XY女性患者均有完全性腺发育不良，这与SRY在睾丸形成早期起关键作用相一致，这些患者的外生殖器和正常女性一样，由于完全的性腺发育不良和卵巢功能丧失，临床上表现为原发性闭经，50%的病例伴发性腺肿瘤（性腺胚胎细胞瘤和无性细胞瘤），手术中需常规切除性腺［13］。SRY的突变大多是新生突变，错义突变则集中于基因的中心区，即编码HMG box的序列。这强烈支持DNA结合基序的重要作用。但并不是所有SRY突变都导致完全的性反转。Jordan和Brian K等［14］在1例家族性SRY突变的病例中，发现XY女性反转患者父亲也携带相同SRY突变，但却有正常表型和生育能力，认为这可能与修饰基因的影响有关，患者与她父亲携带不同的修饰等位基因会导致不同的表型。本研究发现，尿道下裂患儿的SRY几乎阳性，仅DSD的患儿SRY出现阴性结果。我们推断，尿道下裂患儿在胚胎发育的起始期，作为性别启动的SRY并没有出现问题，尿道下裂患儿从一开始是按男性生殖器发育，尿道发育的障碍可能和SRY级联的下级基因突变相关，或者是多基因联合作用的结果。

染色体和其核型的改变是尿道下裂形成的原因，对于外生殖器分化模糊，我们需要通过性染色体及核型的检查以做出明确诊断，并结合临床其它检查，明确DSD诊断。

1 夏家辉．染色体病．《人类染色体病》［M］，北京：科学出版社，1987：189—268．Xia JH．Chromosomal Diseases，Human Chromosomal Diseases［M］，Beijing：Science Press，1987，189—268．

2 黄澄如．小儿泌尿外科学 ［M］，济南：山东科学技术出版社，1996：182．Huang CR．Pediatric Urology［M］，Jinan：Shandong Science and Technology Press，1996：182．

3 Ratan ZA，Zaman SB，Mehta V，et al．Application of Fluorescence In Situ Hybridization（FISH）Technique for the Detection ofGenetic Aberration in Medical Science Cureus［J］．2017，9（6）：e1325．DOI：10．7759／cureus．1325．

4 De Sousa SM，Kassahn KS，McIntyre LC，etal．Case report of whole genome sequencing in the XY female：identification of a novel SRY mutation and revision of a misdiagnosis of androgen insensitivity syndrome［J］．BMC Endocr Disord，2016，16（1）：58．DOI：10．1186／s12902—016—0141—7

5 夏爱丽，周惠耕，周黎明，等．95例大Y染色体核型的临床效应分析［J］．浙江临床医学，2008，4（04）：440—441．DOI：10．3969／j．issn．1008—7664．2008．04．005．Xia AL，Zhou HG，Zhou LM，et al．Clinical effect analysis of 95 cases of large Y chromosome karyotype［J］．Zhejiang J Clin Med，2008，4（04）：440—441．DOI：10．3969／j．issn．1008—7664．2008．04．005．

6 沈婉英．汉族男性Y染色体相对长度152例分析［J］．遗传与疾病，1990，7（1）：37—38．Shen WY．Analysis of the relative length ofmale Y chromosome in han nationality（152cases）［J］．Genetics and Diseases，1990，7（1）：37—38．

7 Halliday J，Oke K，Breheny S，et al．Beckwith-Weidemann syndrome and IVF：a case-control study［J］．Am J Hum Genet，2004，75（3）：526—528．

8 Arnold AP．A General Theory of Sexual Differentiation［J］．J Neurosci Res，2017，95（1—2）：291—300．DOI：10．1002／jnr．23884．

9 Carmichael SL，Ma C，Choudhry S，et al．Hypospadias and genes related to genital tubercle and early urethral development［J］．JUrol，2013，190（5）：1884—1892．DOI：10．1016／j．juro．2013．05．061．

10 Tanaka SS，Nishinakamura R．Regulation ofmale sex determination：genital ridge formation and Sry activation in mice［J］．Cell Mol Life Sci，2014，71（24）：4781—4802．DOI：10．1007／s00018—014—1703—3．

11 Harley VR，Layfield S，Mitchell CL，et al．Defective importinβrecognition and nuclear import of the sex-determining factor SRY are associated with XY sex-reversing mutations［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（12）：7045—7050．DOI：10．1073／pnas．1137864100．

12 Munger SC，Natarajan A，Looger LL，et al．Fine time course expression analysis identifies cascades of activation and repression and maps a putative rRegulator of mammalian sex determination［J］．PLos Genet，2013，9（7）：e1003630．DOI：10．1371／journal．pgen．1003 630．

13 Hersmus R，Stoop H，Turbitt E，etal．SRY mutation analysis by next generation（deep）sequencing in a cohort of chromosomal Disorders of Sex Development（DSD）patientswith amosaic karyotype［J］．BMC Med Genet，2012，13：108．DOI：10．1186／1471—2350—13—108．

14 Brian K，Jordan，Mansoor Mohammed，et al．Up-regulation of WNT-4 signaling and dosage-sensitive sex reversal in humans［J］．Am J Hum Genet，2001，68（5）：1102—1109．DOI：10．1086／320125．

Chromosomal and karyotypic testing of hypospadias

．
Zu Jiancheng，Yong Jiang，Hu Jiangjun，Liu Yu，Zhao Yaowang，He Jun．
Department of Urology，Hunan Children's Hospital，Changsha 410007，China．Corresponding author：He Jun，Email：hjys840808＠163．com

ObjectiveTo preliminarily determine the relationship between chromosomal and karyotypic detection and hypospadias．MethodsThe chromosomes and karyotypeswere detected by an automatic analyzer．ResultsChromosomal detection of hypospadias was abnormal（10／137，7．29%）．And the clinical types were I（2／46，4．3%），Ⅱ（3／41，7．3%），Ⅲ（2／26，7．6%）andⅣ（3／24，12．5%）．SRY detection was negative（n＝1）with a genotype of45，xy21／46，xyr（21）／46，xy，r（21；21），bilateral testicular biopsy revealed both testicular and ovarian tissues．The diagnosiswas disorder of sex development．ConclusionChromosome and karyotype changesmay predispose to the formation of hypospadias．So far a dozen types chromosomal aberrations have been identified．For differentiating vague external genitalias，such as hypospadias and penislike clitoral enlargement，gender is often difficult to determine．An examination of sex chromosomes helps to make a definite diagnosis．Based upon the results of chromosomal testing and clinical examinations，disorder of sex development is ascertained．

Hypospadias；Chromosomes；Karyotyping

10．3969／j．issn．1671—6353．2017．06．012

湖南省科技厅资助项目（2008RS4030）

湖南省儿童医院泌尿外科（湖南省长沙市，410007）

何军，Email：hjys840808＠163．com

2017—01—22）

本文引用格式：祖建成，雍江，胡建军，等．尿道下裂患儿染色体及核型分析［J］．临床小儿外科杂志，2017，16（6）：580—582．

10．3969／j．issn．1671—6353．2017．06．012．

Citing this article as：Zu JC，Yong J，Hu JJ，et al．Chromosomal and karyotypic testing of hypospadias［J］．JClin Ped Sur，2017，16（6）：580—582．DOI：10．3969／j．issn．1671—6353．2017．06．012．