广州市售瓶（桶）装水中铜绿假单胞菌污染现状及其耐药现象研究

周臣清，张 娟，黄宝莹，佘之蕴，范安妮，赵 玲

（广东产品质量监督检验研究院，广东 佛山 528300）

广州市售瓶（桶）装水中铜绿假单胞菌污染现状及其耐药现象研究

周臣清，张 娟，黄宝莹，佘之蕴，范安妮，赵 玲

（广东产品质量监督检验研究院，广东 佛山 528300）

为了解广州市售瓶（桶）装水中铜绿假单胞菌的污染现状及其耐药状况，采用国标GB 8538—2016对抽查的392件瓶（桶）装水样品进行检测，用革兰氏阴性菌药敏卡片（AST-GN09）对阳性菌株进行药敏实验。结果表明，392件样品中铜绿假单胞菌检出率为5.1%，不合格样品均为桶装水，纯净水检出率为6.3%，矿泉水检出率为2.4%；按抽查月份分析，检出率从高到低依次为：6月（16%）＞8月（7.0%）＞7月（5.6%）＞4月（3.8%）＞5月（2.0%）＞3月（0）；药敏结果显示，95%（19/20）的菌对所有11种抗生素完全敏感，并发现一株7重耐药菌株。瓶（桶）装水中铜绿假单胞菌污染与产品包装方式极显著相关（P＜0.01），而与产品过滤方式无关，6月的检出率极显著高于其他月份（P＜0.01），水源性铜绿假单胞菌抗生素耐药性处于较低水平。

铜绿假单胞菌；瓶装水；桶装水；耐药性

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的环境微生物，为重要的食源性和水源性致病菌，其分布广泛，具有很强的环境适应能力，且具有天然耐药性[1]。近年来，时有成品水中检出铜绿假单胞菌的报道，马群飞等[2]在福建省80份矿泉水中18份检出铜绿假单胞菌，检出率为22.5%，魏磊等[3]在全国共9省采集108份水样30份检出铜绿假单胞菌，检出率为31.5%，李莉等[4]在连云港市采集150件桶装水检出39件桶装水，检出率为26.0%。国外亦有相应报道，VARGA L[5]在匈牙利492份水样7份检出铜绿假单胞菌，检出率为1.4%。国内外各地水中铜绿假单胞菌检出率不尽相同，但均显示了一定的污染率，而广州地区尚未有系统的调查瓶（桶）装水中铜绿假单胞菌的污染状况。

铜绿假单胞菌具有多种致病因子，可以导致急性肠道疾病和皮肤炎症的发生，抵抗力低下的群体饮用了被铜绿假单胞菌污染的瓶装水很有可能导致相关疾病的发生[6]。由于抗生素的广泛使用，在临床上，铜绿假单胞菌一直是医院内感染的主要致病菌之一，据张祎博等[7]的调查显示，2014年在所有临床分离株中铜绿假单胞菌占9.5%，其对各抗菌药物的敏感率在38.5%～83.7%之间（2005～2014），且其中1.7%为泛耐药菌株（即对所有抗生素耐药）。铜绿假单胞菌具有高耐药性的特点，而目前中国少有研究涉及食源性或水源性铜绿假单胞菌耐药性的研究。

为了解广州市售瓶（桶）装水中铜绿假单胞菌污染情况，本研究采用国标GB 8538—2016《饮用天然矿泉水检验方法》共对广州地区167家瓶装水生产企业的392件瓶装水样品进行检测，用革兰氏阴性菌药敏卡片（AST-GN09卡）对分离得到的铜绿假单胞菌进行药敏试验，以期为监管部门防控铜绿假单胞菌污染提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

革兰氏阴性菌生化鉴定卡（GN卡）、革兰氏阴性菌药敏卡片（AST-GN09卡）（含实验药物）：法国梅里埃公司；0.45 μm滤膜：美国Millipore公司；假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂、乙酰胺肉汤、金氏B（King's B）培养基、钠氏试剂、标准菌株铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginos）ATCC 27853和大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922：广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

VITEK 2 Compact微生物全自动鉴定系统：法国生物梅里埃公司；HTY-30B不锈钢六联过滤系统：浙江泰林生物技术股份公司；GHP-9160隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；CL-40M高压蒸汽灭菌锅：日本ALP公司。1.3方法

1.3.1 采样及细菌分离

2017年3月至2017年8月，按照随机抽样法，从广州市流通环节上销售的各品牌瓶（桶）装饮用水抽取392件尚在保质期内的样品，其中纯净水268件，矿泉水124件。根据GB 8538—2016《饮用天然矿泉水检验方法》[8]，将250 mL水样用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，然后用无菌镊子将滤膜移至CN琼脂培养基上，于（36±1）℃恒温培养箱中培养48h，用微生物全自动鉴定系统对可疑菌进行确认。以铜绿假单胞菌ATCC27853作为阳性对照菌株，以大肠埃希氏菌ATCC25922作为阴性对照菌株。将分离得到的阳性菌株用甘油保存法保存于-70℃冰箱中。

1.3.2 抗生素敏感实验

本研究采用法国梅里埃公司的革兰氏阴性菌药敏卡片（AST-GN09卡）对分离得到的20株铜绿假单胞菌进行药敏试验，试验的药物分别为：哌拉西林（piperacillin，PRL）、哌拉西林/他唑巴坦（tazobactam，TZP）、头孢他啶（ceftazidime，CAZ）、盐酸头孢吡肟（cefepime，FEP）、亚胺培南（imipenem，IMP）、美罗培南（meropenem，MEM）、阿米卡星（amikacin，AMK）、庆大霉素（gentamicin，GEN）、妥布霉素（tobramycin，TOB）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）和左氧氟沙星（levofloxacin，LVX）共11种抗生素，以铜绿假单胞菌ATCC 27853作为质控菌株。

2 结果与分析

2.1 广州市流通环节水中铜绿假单胞菌污染情况

由表1可知，392件瓶（桶）装水中有20件检出铜绿假单胞菌，总体污染率为5.1%，其中6月抽查的50件样品，有8件样品检出铜绿假单胞菌，检出率最高，达到16.0%，其次为8月份（3/43，7.0%），7月次之（5/90，5.6%），4月次之（3/79，3.8%），5月次之（1/50，2.0%），而3月份抽查的瓶（桶）装水未检出铜绿假单胞菌（0/80）。6月份抽检的瓶（桶）装水的铜绿假单胞菌检出率极显著高于其他月份抽检的瓶装水（P＜0.01）。

表1 2017年3～8月广州市瓶（桶）装水中铜绿假单胞菌检出情况Table 1 Detection results ofP．aeruginosain bottled water&barreled water from March to August 2017，Guangzhou

广州地区的瓶（桶）装水总体保持在较低的污染水平，桶装水在6月铜绿假单胞菌检出率极显著高于其他月份的检出率（P＜0.01），这可能跟温湿度有关，铜绿假单胞菌其最适生长温度为25～30℃，并喜欢在潮湿的环境中繁殖，在广州地区6月正值梅雨季节，温湿度均在铜绿假单胞菌最适范围内，而在3月份，气温较低且气候较为干燥，不利于其生长。

2.2 铜绿假单胞菌检出与产品包装及过滤方式的相关性

392件样品按包装分为瓶装水和桶装水，按过滤方式分为纯净水和矿泉水。铜绿假单胞菌检出与产品包装及过滤方式的相关性的分析见表2、表3。

表2 铜绿假单胞菌检出与产品包装的相关性Table 2 Correlation betweenP．aeruginosadetection and product packaging

表3 铜绿假单胞菌检出与产品过滤方式的相关性Table 3 Correlation betweenP．aeruginosadetection and product filtration mode

由表2可知，本次抽查检出的铜绿假单胞菌均来自桶装水，瓶装水中未检出铜绿假单胞菌。瓶装水和桶装水之间的铜绿假单胞菌检出率存在极显著差异（P＜0.01）。由表3可知，按过滤方式分析，纯净水有268件，其中17件检出铜绿假单胞菌，矿泉水124件，3件检出铜绿假单胞，检出率分别为6.3%和2.4%。纯净水和矿泉水的铜绿假单胞菌检出无显著差异（P＞0.05）。本次抽查认为铜绿假单胞菌的污染与产品包装方式有关，而与产品的过滤方式无关。

对结果进行分析，桶装水的污染情况极显著高于瓶装水可能是由于桶装水的灌装环节或包装环节消毒不彻底造成的[9]（P＜0.01），桶装水生产过程中桶装包装反复使用，且桶身的体积较大，消毒难度较大，小微企业自动化程度较低，手工程序多，而铜绿假单胞菌是一种常见的环境致病菌，从而造成产品污染机会增加。矿泉水生产主要以物理手段去除微生物，而纯净水生产则消毒手段比较多样[9]，通过本次抽查可知矿泉水和纯净水中铜绿假单胞菌污染水平相当，这说明铜绿假单胞菌虽然对常规消毒手段具有较强的抗性，但如确保生产企业过滤和纯化系统的正常运转，并在滤膜及反渗透膜系统前增加紫外杀菌装置等，可以在一定程度上控制铜绿假单胞菌的污染。

2.3 分离菌株抗生素药敏结果

对分离得到的20株铜绿假单胞菌进行抗生素抗性测试，结果见表4。由表4可知，其中有19株菌对所有抗生素都敏感（占95%），所有菌对哌拉西林/他唑巴坦，头孢他啶，环丙沙星和左氧氟沙星这4种抗生素都不耐药，有1株铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）-03对哌拉西林/头孢吡肟/亚胺培南/美罗培南/阿米卡星/庆大霉素/妥布霉素共7种抗生素具有抗性。

表4 20株铜绿假单胞菌的药敏结果Table 4 Antibiotic susceptibility tests results of 20 P.aeruginosastrains

对比国内其他报道，李飞[10]收集的69株水源性铜绿假单胞菌和魏磊等[3]筛查得到的30株水源性铜绿假单胞菌均未发现耐药性，2016年曾晓琮等[11]研究表明23株水源性铜绿假单胞菌则对磺胺甲基异恶唑/甲氧苄氨嘧啶、四环素、米诺环素的耐药率分别为69.4%、13.2%和39.2%。对比临床上，国内外的报告均显示[12-16]，临床分离株的耐药水平要远高于水源性分离株的耐药水平，这与铜绿假单胞菌所处的环境不同相关。本研究发现水源性铜绿假单胞菌总体上耐药水平较低，与国内同行报道基本一致，但仍发现了一株7重耐药菌株，研究表明[6，12]，多重耐药铜绿假单胞菌几乎具有目前已知的所有细菌耐药机制，是引起获得性肺炎主要细菌之一，其引起的院内感染治疗难度极大。因此，有必要评估水源性铜绿假单胞菌的耐药特征及耐药变化趋势，加强铜绿假单胞菌耐药机制的研究，并加强监测饮用水中铜绿假单胞菌的污染现状及其耐药情况，从而保障广大消费群体的饮水安全。

3 结论

本次抽查结果显示，广州市瓶（桶）装水中铜绿假单胞菌污染率总体处于较低水平，总体污染率为5.1%（20/392），铜绿假单胞菌污染与产品包装方式极显著相关，而与产品过滤方式无关，具体表现为桶装水中铜绿假单胞菌污染水平远高于瓶装水，而纯净水与矿泉水中铜绿假单胞菌检出率无显著差别；瓶（桶）装水中铜绿假单胞菌污染具有一定的季节性，其中6月份铜绿假单胞菌的检出率极显著高于其他月份的检出率（P＜0.01）。药敏结果显示，水源性铜绿假单胞菌耐药性总体处于较低水平，但仍存在一定的抗药性，发现一株7重耐药菌株，这值得引起相关部门的注意。卫生及监察部门应继续加强对本地区饮用桶装水的监督管理力度，保障群众的饮水健康。

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Contamination status ofPseudomonas aeruginosain bottled water and barreled water in Guangzhou and analysis of its antimicrobial resistance

ZHOU Chenqing,ZHANG Juan,HUANG Baoying,SHE Zhiyun,FAN Anni,ZHAO Ling
（Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision,Foshan 528300,China）

The contamination situation and resistance characteristics ofPseudomonas aeruginosafrom bottled water&barreled water in Guangzhou were investigated.P.aeruginosawas detected according to national standard GB 8538—2016,antibiotic susceptibility tests were carried out by AST-GN09 cards.A total of 392 samples were examined and the positive detection rate ofP.aeruginosawas 5.1%,all unqualified samples were barreled water,and the detection rate of purified water was 6.3%,while the detection rate of mineral water was 2.4%.The detection rate ranged from high to low by time was June （16%）,August（7.0%）,July （5.6%）,April（3.8%）,May （2.0%）,March （0）.The results of antibiotic susceptibility tests showed that 95% （19/20）strains were completely sensitive to all 11 antibiotics and a strain resistant to seven kinds of antibiotics was found.The detection rate ofP.aeruginosawas extremely significantly correlated with the product packaging method （P＜0.01）,but not related to the product filtration mode.The detection rate ofP.aeruginosain June was extremely significantly higher than that in other months （P＜0.01）,and the resistance of water-borneP.aeruginosaantibiotics was at a low drug resistance level.

Pseudomonas aeruginosa;bottled water;barreled water;antimicrobial resistance

Q93-3

0254-5071（2017）12-0168-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.035

2017-10-13

广东产品质量监督检验研究院院长基金项目（JFB2016011）

周臣清（1988-），男，工程师，硕士，研究方向为食品安全与微生物检测。