活体外黄芪根腐病菌细胞壁降解酶产生能力比较

岳换弟+秦雪梅+王梦亮

摘要：利用细胞壁降解酶（CWDEs）是镰刀菌（Fusarium sp.）侵染寄主的主要手段之一，不同种类的镰刀菌在致病过程中起主要作用的降解酶种类有所不同。以山西省黄芪（Astragalus L.）根腐病的优势病原菌锐顶镰刀菌[F. acuminatum （Ellis et Everhart） Wr.]、腐皮镰刀菌[F. solani （Mart） Sacc.]和尖孢镰刀菌（F. oxysporum Schlecht）为研究对象，对其活体外诱导培养产生的主要细胞壁降解酶（多聚半乳糖醛酸酶、聚甲基半乳糖醛酸酶、多聚半乳糖醛酸反式消除酶、果胶甲基反式消除酶、内切1，4-β-D葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶）及其变化规律进行了比较。结果表明，3种根腐病菌均能产生多聚半乳糖醛酸酶、聚甲基半乳糖醛酸酶、多聚半乳糖醛酸反式消除酶、果胶甲基反式消除酶、内切1，4-β-D葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶6种CWDEs，但不同的致病菌产生各种酶的活性大小和变化趋势具有明显差异。该结果为深入研究CWDEs在根腐病菌侵染黄芪过程中的致病作用奠定了基础。

关键词：黄芪根腐病菌；细胞壁降解酶；产生能力；致病作用

中图分类号：S435.672.2+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）22-4328-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.22.030

Abstract： Producing cell wall degrading enzymes（CWDEs） is one of the main means of the Fusarium sp. infecting its host plants. Different kinds of Fasarium may have different CWDEs which are more active than other CWDEs in the infection process. In this paper， research was made into the main CWDEs produced by the dominant pathogens of Astragalus L. root rot in Shanxi province such as F. acuminatum （Ellis et Everhart） Wr.，F. solani （Mart） Sacc.and F. oxysporum Schlecht and the rules of their changes. A series of CWDEs including polygalacturonase（PG），polymethylgalacturonase （PMG），polygalacturonic acid transeliminase （PGTE），pectin methyltranseliminase （PMTE），carboxymethyl cellulose （Cx），β-glucosidase （βG），were detected by the induction and culture in vitro. The results show that the 3 kinds of root rot pathogens all produced PG，PMG，PGTE，PMTE，Cx and βG，but significant differences existed in the activities and dynamic changes of each of the various enzymes produced by these pathogens. The above results laid the foundation for further study on the pathogenicity of CWDEs in the infection of root rot pathogens.

Key words： root rot pathogen of Astragalus； cell wall degrading enzyme； production capacity； pathogenicity

黄芪（Astragalus L.）为豆科（Leguminosae）多年生草本植物，以根入药，性温、味甘，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效，是药用价值很高的中药材。近年来黄芪根腐病在其主产地（甘肃省、内蒙古自治区、山西省）均已普遍发生，该病害由多种病菌混合侵染造成，且不同产地优势致病菌常有变化[1]，镰刀菌（Fusarium sp）是引起黄芪根腐病的优势致病菌属。本课题研究发现，引起山西黄芪根腐病的优势病菌主要为锐顶镰刀菌[F. acuminatum（Ellis et Everhart） Wr.]、腐皮镰刀菌[F. solani（Mart） Sacc.]和尖孢镰刀菌（F. oxysporum Schlecht）。镰刀菌寄主范围广、种类繁多、变异性强、易蔓延、发病率高，可侵染大多数植物并造成毁灭性后果，其生化致病机制也非常复杂，有多种毒素和细胞壁降解酶（CWDEs）参与[2]。其中CWDEs主要作用是降解寄主植物的细胞壁，从而利于病原菌的侵入、定殖与扩展[3]，是镰刀菌侵入寄主、致病的主要帮凶之一。研究表明，镰刀菌分泌的CWDEs主要包括多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）、聚甲基半乳糖醛酸酶（Polymethylgalacturonase，PMG）、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（Polygalacturonic acid transeliminase，PGTE）、果胶甲基反式消除酶（Pectin methyltranseliminase，PMTE）、果胶甲基脂酶（Pectin methylesterase，PME）、内切1，4-β-D葡聚糖酶（Carboxymethyl cellulose，Cx）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，βG）等。CWDEs降解寄主細胞壁的程度常常与疾病的严重程度相关[4]。评价病原菌CWDEs在致病过程中的作用，主要依据病原菌在体外产生降解酶的能力和降解酶破坏植物组织结构的能力[5]。不同镰刀菌活体外诱导培养产生的CWDEs种类和活性均存在差异。如高增贵等[6]发现，玉米茎腐病菌（F. graminearum Schwabe）在活体外产生6种CWDEs，其活性从高到低依次为PG、PMG、Cx、PME、PGTE和PMTE；胡长志等[7]发现，莲腐败病菌[F. oxyporum Schl.f.sp.nelumbicola（Nis.&Wat.）Booth]在活体外诱导产生的PG、PMG、Cx活性均明显高于PGTE、PMTE。也有研究表明，病原菌的致病力可能与其活体外产生CWDEs的能力相关。如赵艳琴等[8]在诱导培养烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani Kiihn）产CWDEs的过程中，发现强致病力菌株产酶能力强于弱致病力菌株。由此可见，病原菌活体外诱导培养产生CWDEs的研究可为明确其致病机理和CWDEs在侵染植物过程中的作用提供理论依据。目前，对于黄芪根腐病菌的生化致病机制研究还很薄弱，特别是相关病原菌产生的CWDEs在致病过程中的作用还未见报道。据此，试验以山西省黄芪根腐病的优势病原菌F. acuminatum、F. solani、F. oxysporum为对象，对其活体外诱导培养产生的主要CWDEs（PG、PMG、PGTE、PMTE、Cx、βG）及其变化规律进行了探讨，以期为明确CWDEs在根腐病菌混合侵染中的作用，进而探讨其和黄芪的生化互作机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黄芪根腐病菌F. acuminatum、 F. solani、 F. oxysporum由课题组在2013年从山西省浑源、五寨、应县等县黄芪发病植株中分离纯化鉴定而来。

1.2 根腐病菌CWDEs的活体外诱导培养和提取

1.2.1 根腐病菌的活化和培养 将F. oxysporum、 F. solani、F. acuminatum分别接入PDA平板，25 ℃下活化3-6 d后，用打孔器沿菌落边缘各打取5个菌碟（直径5 mm），分别接入100 mL PD培养液中，在25 ℃、180 r/min条件下振荡培养3-5 d后，滤除菌丝，用无菌水制备各病菌的孢子悬浮液，使其终浓度均为1.5×106～2.5×107 cfu/mL，备用。

1.2.2 CWDEs的诱导培养和提取 参照陈捷[9]的方法，采用改良的Marcus液体培养基作为诱导根腐病菌产生CWDEs的基础培养基。将3种根腐病菌的孢子悬浮液分别取1 mL接种于装有100 mL产酶培养基的三角瓶（250 mL）中，3次重复；25 ℃、180 r/min振荡培养3、5、7、9、11 d后取样，8层纱布过滤去除菌丝；4 ℃、8 000 r/min离心10 min，上清液用0.45 μm微孔滤膜真空抽滤，除去菌丝和孢子，得粗酶液，4 ℃保存待用[9]。

1.3 CWDEs活力的测定

1.3.1 DNS比色法测定PG、PMG、Cx和βG的活性 ①果胶酶PG和PMG活性测定[10]。取标记为1、2号的2支试管，分别加入预先经50 ℃水浴5 min的1 mL柠檬酸缓冲液和1 mL 1%底物溶液（PG底物为多聚半乳糖醛酸，PMG底物为果胶），1号管加入1 mL粗酶液，50 ℃酶解1 h后，加2 mL DNS试剂，沸水中反应5 min，终止反应；2号管加入1 mL粗酶液，直接加2 mL DNS试剂，沸水中反应5 min，终止反应；分别在OD540 nm处测定1、2号试管中酶液活性。在设定的条件下，以每分钟每毫克蛋白催化底物释放1 μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位（U/mg）。②纤维素酶Cx和βG活性测定[9]。Cx底物是羧甲基纤维素钠，βG底物是水杨苷；且测定方法与果胶酶活性测定方法一致，但纤维素酶的酶解反应时间为30 min，反应完成后在OD540 nm处分别测定活性。在设定的条件下，以每分钟每毫克蛋白催化底物释放1 μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位（U/mg）。

1.3.2 紫外分光光度法测定PGTE和PMTE活性 PGTE和PMTE活性测定[9]都取1.0 mL酶液加1.0 mL pH 9.0的0.05 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和 1 mL底物，PGTE底物为多聚半乳糖醛酸，PMTE底物为果胶，再加1.0 mL 3 mmol/L CaCl2，30 ℃水浴10 min，取1 mL在OD232 nm处测定反应前后的酶液活性，酶活单位为30 ℃下每分钟每毫克蛋白催化底物释放1 mmol不饱和醛酸所需的酶量（U/mg）。

1.4 数据分析

试验所得数据采用Microsoft Office Excel 2007程序处理，并用其制图；应用SPSS 17.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同根腐病菌产PG和PMG能力的比较

不同根腐病菌产PG能力的情况见图1。从图1可以看出，在活体外诱导培养后，3种根腐病菌均能产生PG，但各菌株产PG的能力、PG活性达峰值的时间和活性变化趋势均存在明显差异。F. oxysporum分泌的PG活性在第三天时为1.05 U/mg，此后随之骤降，在第五天至第11天时降至低点并趋于稳定；F. solani产生PG的能力较低，随时间延长活性缓慢增加，第七天时达到高峰，但活性也仅为0.56 U/mg，随后酶活逐渐降低；F. acuminatum产生的PG活性变化趋势在第三天至第七天时同F. solani基本一致，但第九天时活性骤增，达到1.56 U/mg，但第11天时又迅速下降。说明F. acuminatum产PG的能力明显高于其他2种根腐病菌，但活性高峰出现于培养后期，滞后于F. solani和F.oxysporum；F. oxysporum产PG酶的能力较F. acuminatum低，但活性高峰出现较早；而F. solani产PG酶的能力最弱。

不同根腐病菌产PMG能力的情况见图2。从图2可见，3种根腐病菌产PMG的能力明显不同，但活性变化规律基本一致，均在第三天时活性最高，F. acuminatum为0.66 U/mg，F. oxysporum为0.49 U/mg，而F. solani仅为0.18 U/mg。此后随时间延长，F. acuminatum和F. oxysporum产生的PMG活性开始明显降低，其中，F. acuminatum在第九天后趋于稳定；F. oxysporum产生的PMG活性在第七天有微弱下降趋势，并逐渐趋于稳定；F. solani则由于初期酶活性比较低，在第五天微弱降低后，即达到酶活低谷，并保持平稳。表明F. acuminatum产PMG酶的能力最强，F. oxysporum次之，F. solani最低，但3种根腐病菌的PMG活性高峰均在培养前期出现，后期逐渐降低。

2.2 不同根腐病菌产PGTE和PMTE能力的比较

不同根腐病菌产PGTE能力的情况见图3，产PMTE能力的情况见图4。从图3、图4可见，在活体外诱导分泌PGTE和PMTE的过程中，3种根腐病菌产PGTE和PMTE的能力也表现出了明显不同。与PG和PMG产生情况不同，F. solani产生的PGTE活性明显高于其他2种根腐病菌，尽管在第三天到第五天时有一个小的降低变化，但随后酶活性显著升高，并在第九天达到高峰，为3.88×10-3 U/mg，此后虽开始降低，但也明显高于其他2种根腐病菌在同期的酶活；F. oxysporum产生的PGTE活性在第五天时明显升高，达1.53×10-3 U/mg，此后随即降低并在第九天后趋于稳定；F. acuminatum产生PGTE的情况和F. oxysporum不同，在前期無显著变化，直至第九天才出现高峰，为1.55×10-3 U/mg，而后随即降低。反映出F. solani产PGTE的能力明显强于F. acuminatum和F. oxysporum，但其酶活高峰出现相对滞后，与F. acuminatum产PGTE的高峰期一致；F. oxysporum虽然产酶能力较弱，但酶活高峰期出现较早。

在PMTE方面，产PMTE能力最强的为F. acuminatum，其产生的PMTE活性在第五天时明显低于F. oxysporum，但在第七天显著增加，并达到酶活高峰，为10.10×10-2 U/mg，在第11天时才显著降低；F. oxysporum产生的PMTE活性在第三天时为8.10×10-2 U/mg，此后随时间的延长逐渐下降；F. solani产生的PMTE活性随时间延长增加，在第五天达到高峰，为4.11×10-2 U/mg，第五天到第七天活性趋于稳定后又随之下降。表明F. oxysporum先于其他2种根腐病菌达到最高酶活，但F. acuminatum产PMTE酶的能力明显强于其他2种根腐病菌。

2.3 不同根腐病菌产Cx和βG能力的比较

不同根腐病菌产Cx的能力和活性变化情况见图5。从图5可见，F. oxysporum诱导分泌的Cx活性随时间延长升高，第五天达 4.66×10-2 U/mg，随后开始下降，但在第九天又出现第二次小高峰，为3.46×10-2 U/mg，然后再次下降；F. acuminatum产生的Cx活性则在第七天达到高峰，为4.27×10-2 U/mg，此后随之下降；F. solani产Cx的能力最弱，在第三天到第七天 检测不到活性，第九天才开始产生，并在此后显著升高，第11天时酶活达1.94×10-2 U/mg。表明F. acuminatum和F. oxysporum产Cx的能力在培养前期明显强于F. solani，酶活的高峰期也先于F. solani，但F. solani的产Cx能力在后期有逐渐增强的趋势，也可能在时间进一步延长的情况下，达到更高的水平。

不同根腐病菌产βG的能力和活性变化情况见图6。从图6可见，3种根腐病菌活体外诱导分泌βG活性的变化规律基本一致，均随着时间的延长逐渐升高。F. oxysporum诱导分泌的βG在第七天时活性显著升高，第九天达到高峰，为2.54×10-2 U/mg，随后略有下降；F. solani产生的βG活性则随时间的延长一直呈缓慢上升的趋势，第11天活性达2.85×10-2 U/mg；而F. acuminatum诱导分泌的βG活性在第三天即开始迅速升高，此后缓慢增加，在第11天活性达3.57×10-2 U/mg。表明F. acuminatum产βG的能力强于其他2种根腐病菌，且3者产βG的高峰均在培养后期。

3 小结与讨论

病原菌致病因子的研究是明确其致病机制和寻求相应植物抗病途径的前提，大多数植物致病镰刀菌都能分泌各种CWDEs，且不同镰刀菌产生同一种CWDEs的能力和同一种菌产生不同CWDEs的活性均具有明显差异。试验结果表明，3种引起黄芪根腐病的致病镰刀菌F. acuminatum、F. solani和F. oxysporum均能产生4种果胶酶（PG、PMG、PGTE、PMTE）以及2种纤维素酶（Cx、βG），这一结果与董章勇等[11]对香蕉枯萎病菌[F.oxysporum f.sp. cubense（E. F. Sm.）Snyd. & Hans.]的研究基本一致。同时，3种根腐病菌产生的PG和PMG活性明显高于其他4种酶的结果，也与小麦穗腐病菌（F. culmorum（W.G. Smith）Sacc.]产生的果胶酶比纤维素酶和木聚糖酶分泌更早或活性更高的结果基本一致[4]。上述结果表明，PG和PMG作为3种根腐病菌产生的主要CWDEs，可能在致病过程中发挥了主要的作用。但是3种根腐病菌产生的果胶酶和纤维素酶活性存在一定的差异，且各酶达到最高活性水平的时间也不相同。F. oxysporum产生的CWDEs活性大小依次为PG、PMG、PMTE、Cx、βG、PGTE，其中PG、PMG和PMTE均在第三天达最高酶活；而PGTE和Cx在第五天达酶活高峰，βG活性变化滞后于其他5种酶，在第九天达酶活高峰。F. solani产生的CWDEs中，除βG活性高于Cx外，其他酶活性顺序与F. oxysporum基本一致；但活性变化规律存在差异，除PMG外，其他酶的最高活性高峰出现时间均滞后于F. oxysporum。F. acuminatum产生的CWDEs中，除βG酶活性高于PMTE外，其他酶活性顺序与F. oxysporum和F. solani基本一致，其中PMG和βG达最高酶活的时间与F. solani相同；但PG、PMTE和PGTE的酶活高峰出现滞后于F. oxysporum和F. solani，Cx的酶活高峰出现时间先于F. oxysporum但滞后于F. solani。由于镰刀菌CWDEs活性高峰在不同菌株中出现的时间不同，可能会影响病菌侵入寄主的时间，同时也在一定程度上体现了不同镰刀菌在侵染植物过程中的机制差异。本试验中所用的产酶培养基组成和培养条件一致，3种致病镰刀菌产CWDEs的水平取决于菌株本身的生长特征和代谢状况，说明各镰刀菌在致病过程中所起的作用可能不同[12]。

果胶酶是降解植物初生壁层果胶物质的重要酶类，PG主要水解细胞壁中多聚半乳糖醛酸，生成低聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸；而PMG主要水解高度酯化的果胶酸酯α-1，4糖苷键[9]。F. acuminatum产生PG、PMG的能力强于F. solani和F. oxysporum，说明其在降解果胶物质、导致细胞壁结构解体、使植物根部组织软化、腐烂[13]的过程中作用更为明显。果胶裂解酶PGTE优先裂解果胶酸分子中的α-1，4糖苷键，而PMTE主要降解细胞壁中的果胶或甲基酯化的多聚半乳糖醛酸，对未甲基化的多聚半乳糖醛酸不起作用[9]。F. acuminatum产生PMTE的能力明显强于其他2种根腐病菌，也说明其具有更强的降解果胶或甲基酯化的多聚半乳糖醛酸的能力；但F. solani产PGTE的能力更突出，在裂解果胶酸分子中的α-1，4糖苷键时，显示出了更大的优势。纤维素酶活性也影响镰刀菌的致病力[14]，该酶主要降解植物细胞壁中的基质多糖和纤维二糖，其中Cx主要把含葡萄糖基链的半纤维素基质多糖分解为纤维二糖；βG则主要降解纤维二糖为葡萄糖。从这3种根腐病菌产Cx情况来看，F. oxysporum和F. acuminatum降解半纤维素基质多糖的能力明显强于F. solani，但F. solani在培养后期产生的Cx活性骤增，也显示出该菌可能在侵染后期才发挥降解寄主細胞壁纤维素的作用。另外，F. acuminatum产生βG的能力也明显强于F. solani和F. oxysporum。总的来看，在所测定的6种CWDEs中，F. acuminatum产生4种CWDEs的能力强于其他2种菌，这与课题组后期在3种致病菌接种黄芪发病过程中，F. acuminatum表现出致病力最强的结果（待发表）相一致。

病原菌产生CWDEs的机制非常复杂，不但受反应底物的诱导，而且还与其上游一系列基因的表达量、调控序列及环境因子等因素有关，且由于活体外和活体内的环境因素不同，同种病原菌在活体内外产生的CWDEs种类和活性变化并不完全相同。如薛春生等[15]、齐凤坤等[16]的研究均证明了这一点。由此可知，尽管试验比较了3种黄芪根腐病优势致病镰刀菌在活体外产CWDEs的情况，但并不能真正代表病原菌在活体内的变化情况。

另外，根腐病菌侵染黄芪致病的生化过程是一个复杂的体系，致病镰刀菌除产生CWDEs之外，还有毒素和激素等致病因子的存在，这些因子的共同作用才使病原菌侵入寄主植物从而致病；同时，病原菌侵染也会诱导植物产生抗菌物质、激活防御酶系统来抑制CWDEs，以达到抵御病原菌入侵的目的[17]。因此，尽管上述试验为进一步研究根腐病菌与寄主互作的机制提供了依据，但要明确黄芪根腐病菌产生的CWDEs对病菌侵入、扩展的影响还有待于下一步深入探讨。

参考文献：

[1] 高 芬，任小霞，王梦亮，等.中草药根腐病发生现状及微生物农药防治研究进展[J].中国中药杂志，2015，40（21）：4-7.

[2] 叶旭红，林先贵，王一明.尖孢镰刀菌致病相关因子及其分子生物学研究进展[J].应用与环境生物学报，2011，17（5）：759-762.

[3] JONKERS W，RODRIGUES C D A，REP M. Impaired colonization and infection of tomato roots by the frp1 mutant of Fusarium oxysporum correlates with reduced CWDE gene expression[J].Mol Plant Microbe In，2009，22（5）：507-518.

[4] KANG Z，BUCHENAUER H. Ultrastructural and cytochemical studies on cellulose，xylan and pectin degradation in wheat spikes infected by Fusarium culmorum[J].J Phytopathol，2000， 148：263-275.

[5] 谢联辉.普通植物病理学[M].第二版.北京：科学出版社，2006.258.

[6] 高增贵，陈 捷，高洪敏，等.玉米茎腐病菌产生的细胞壁降解酶种类及其活性分析[J].植物病理学报，2000，30（2）：148-151.

[7] 胡长志，孙晓棠，汪和贵，等.莲腐败病菌细胞壁降解酶的提取及活性分析[J].生物灾害科学，2016，39（1）：14-19.

[8] 赵艳琴，吴元华，伏 颖，等.烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）细胞壁降解酶活性分析及其致病作用[J].烟草科技，2014（11）：84-88.

[9] 陳 捷.现代植物病理学研究方法[M].北京：中国农业出版社，2005.138-156.

[10] DOUAIHER M N，NOWAK E，DURAND R，et al. Correlative analysis of Mycosphaerella graminicola pathogenicity and cell walldegrading enzymes produced in vitro：The importanee of xylanases and polygalacturonases[J].Plant Pathol，2007，56：79-86.

[11] 董章勇，王 琪，秦世雯，等.香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种细胞壁降解酶的比较[J].植物病理学报，2010，40（5）：463-468.

[12] 高树广，赵 辉，李伟峰，等.芝麻茎点枯病菌两种细胞壁降解酶活性分析[J].植物保护，2015，41（5）：75-78.

[13] KIKOT G E，HOURS R A，ALCONADA T M. Contribution of cell wall degrading enzymes to pathogenesis of Fusarium graminearum：Areview[J].J Basic Microb，2009，49（3）：231-240.

[14] 高晓敏，王琚钢，马立国，等.尖孢镰刀菌致病机理和化感作用研究进展[J].微生物学通报，2014，41（10）：2143-2148.

[15] 薛春生，何瑞珏，肖淑芹，等.辣椒疫霉菌细胞壁降解酶种类与活性分析[J].沈阳农业大学学报，2016，47（1）：8-12.

[16] 齐凤坤，康立功，许向阳，等.番茄芝麻斑病原菌产生的细胞壁降解酶种类及其活性变化[J].植物保护，2010，36（5）：47-51.

[17] 张桂芝，杨世忠，张维一.酚类物质对哈密瓜两种主要致腐病原产生的细胞壁降解酶活性的影响[J].食品科学，2006，27（8）： 125-129.