紫甘蓝提取液对人乳腺癌细胞生长和迁移的抑制作用

徐颖倩 曾 雪 唐 倩

(重庆医药高等专科学校药学院，重庆，401331)

紫甘蓝提取液对人乳腺癌细胞生长和迁移的抑制作用

徐颖倩 曾 雪 唐 倩

(重庆医药高等专科学校药学院，重庆，401331)

目的：探讨紫甘蓝提取物对乳腺癌细胞MCF7生长和迁移的抑制作用。方法：应用MTT法检测不同浓度紫甘蓝提取物对MCF7增殖的抑制作用，并用倒置相差显微镜观察细胞形态，Annexin V-FITC/PI染色细胞后用流式细胞术检测不同浓度紫甘蓝提取物对MCF7凋亡的影响，采用Transwell法检测不同浓度紫甘蓝提取物对MCF7迁移的影响。采用SPSS 16.0软件对实验结果进行统计学处理。结果：紫甘蓝提取物可抑制MCF7的增殖，并呈浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05)，也使MCF7形态发生了异常变化，紫甘蓝提取物可诱导MCF7凋亡、抑制其迁移，且呈浓度-效应关系(P<0.05)。结论：紫甘蓝提取物可抑制乳腺癌细胞MCF7生长和迁移。

紫甘蓝；乳腺癌；细胞增殖；细胞凋亡；细胞迁移

紫甘蓝又称红甘蓝、赤甘蓝，俗称紫包菜，十字花科、芸苔属甘蓝种中的一个变种，是结球甘蓝中的一个类型，由于它的外叶和叶球都呈紫红色，故名[1]。紫甘蓝营养丰富，含有丰富的维生素和胡萝卜素，无机盐含量也很高，是膳食纤维的良好来源，其抗氧化活性多酚类和黄酮类物质的含量也比其他蔬菜高[2-3]。国内外大部分关于紫甘蓝的研究都关注于其抗氧化作用[4-5]，但是对紫甘蓝抗癌活性作用的相关研究鲜有报道。本研究旨在探讨紫甘蓝提取物对乳腺癌细胞生长和迁移的抑制作用，为人们在膳食方面预防癌症提供指导意见，对防癌保健食品的开发提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人乳腺癌细胞MCF7购于南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2 药物 新鲜紫甘蓝购于重庆市重百超市建议鉴定基原，无机械损伤，无虫害，无腐烂。

1.1.3 试剂与仪器 细胞培养液RPMI1640、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司)；青霉素、链霉素(Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；Staurosporine(MCE公司)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(上海贝博生物有限公司)；Transwell小室(Millipore公司)；6、24、96孔板(ThermoFisher公司)：酶联免疫检测仪(Bio-Rad公司)；倒置显微镜IX71(Olympus公司)；流式细胞仪(碧迪医疗器械有限公司)；离心机(长沙湘仪离心仪器有限公司)；冷冻干燥机(Thermo公司)；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 称取500 g新鲜紫甘蓝，洗净，晾干，用榨汁机榨取，收集汁液，将该汁液以3 000 r/min离心15 min，取上清液，25 ℃恒温箱内静置过夜后，将该上清液经滤纸反复过滤，再用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，所滤过的澄清液体即为紫甘蓝原液。将紫甘蓝原液冷冻干燥24 h，冻干粉末溶解于蒸馏水中，制备成紫甘蓝提取液(Purple Cabbage Extract，PCE)。实验分组：空白对照组(MTT试验)、正常对照组、阳性药物Staurosporine(STS)(浓度250 nmol/L)对照组(MTT试验、细胞凋亡试验)、PCE处理组(PCE终浓度分别为50、100、150、200、250、300 μg/L)。

1.2.2 干预方法 PCE和阳性药物STS直接干预MCF7细胞。

1.2.3 检测指标与方法 采用形态学观察法和MTT法检测PCE对MCF7的抑制作用，应用流式细胞术检测PCE对MCF7凋亡的影响，Transwell法检测PCE对MCF7迁移的影响。

用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液常规培养MCF7细胞，当细胞生长至80%～90%致密单层时，消化细胞并制备细胞悬液，将1×105个/mL浓度的细胞悬液接种于96孔培养板中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中预培养24 h后，分别加入不同浓度的PCE，使最终每组含PCE浓度分别为50、100、150、200、250、300 μg/L，并设空白对照组、正常对照组和STS(浓度250 nmol/L)对照组，继续培养24 h，于倒置相差显微镜下观察细胞形态。分别于12、24、36 h 3个时相进行MTT比色：弃旧培养液，洗涤细胞后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min使蓝紫色的结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上选择490 nm波长，以空白对照孔调零，测定各个孔的吸光度(A)值。按公式“(1-药物组A值/正常对照组A值)×100%”计算细胞抑制率，每组设置6个复孔，进行3次重复实验，求其平均值，以剂量和生长抑制率做直线相关分析。

将MCF7细胞以1×105个/mL浓度接种于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，分别加入终浓度为150、200、250、300 μg/L的PCE，并设正常对照组和STS(浓度250 nmol/L)对照组。继续培养24 h后，消化细胞并制备细胞悬液，1000 r/min，25 ℃，离心5 min，弃上清液，收集MCF7细胞。向MCF7细胞加入Annexin V结合液重悬细胞，调节细胞浓度为1×106个/mL，按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

将预先饥饿处理了12 h的MCF7细胞以1×106个/mL浓度种植于Transwell(膜孔径8 μm，膜直径6.5 mm)上室，下室分别加入1 mL终浓度为150、200、250、300 μg/L的PCE，并设正常对照组，继续培养24 h。将迁移到Transwell小室膜外侧的MCF7细胞用95%乙醇固定10 min，然后用0.1%结晶紫染色15 min。在倒置显微镜(×200)下，随机观察12个高倍视野，计数迁移细胞数，每2个视野取均数得6个取均后的细胞数。每组实验重复3次。

2 结果

不同质量浓度的PCE作用于MCF7细胞后，对细胞的生长具有不同程度的抑制作用。当PCE作用细胞12 h时，随着其浓度的提高，其对MCF7细胞的抑制作用逐渐增强，随后通过延长PCE的作用时间发现，相同浓度的PCE随作用时间延长，其抑制MCF7细胞的能力也随着增强(图1)。当PCE浓度大于250 μg/L，并且作用24 h以上时，其对MCF7细胞的抑制率能达到50%以上。检测到STS作用于MCF7细胞24 h和36 h后，其抑制率分别为(52.37±1.46)%和(65.14±1.58)%。

图1 PCE对MCF7细胞的抑制作用

正常条件下培养的MCF7细胞生长状态良好，细胞排列紧密，细胞呈扁平、多角形或梭形，边界清楚，大小均匀；STS阳性药物处理过的细胞出现收缩、变圆、体积变小，细胞间隙增宽，细胞排列紊乱；50 μg/L的PCE作用于细胞后，与正常对照组比较，细胞的形态无明显变化；100 μg/L的PCE作用于细胞后，细胞数量与正常对照组比较有所减少，但是细胞形态正常，无损伤迹象；当PCE的浓度达到150 μg/L时，细胞的形态与正常对照组比较出现了明显的变化，细胞开始收缩、变圆、变小，其形态和阳性药物STS组相似，并且随着PCE浓度的增加，细胞的数量和密度逐渐变少(图2)。

图2 PCE对MCF7形态的影响(×100)

图3 PCE对MCF7细胞凋亡的影响

组别凋亡率(%)正常对照组5.31±0.24STS对照组(250nmol/L)42.53±0.27PCE处理组(150μg/L)23.49±0.30PCE处理组(200μg/L)34.72±0.31PCE处理组(250μg/L)41.48±0.26PCE处理组(300μg/L)62.93±0.35

图4 PCE对MCF7细胞迁移的影响

STS对照组细胞早期凋亡区域和晚期凋亡区域的细胞数量明显多于正常对照组(图3)，150 μg/L的PCE作用于MCF7细胞后，早期凋亡的细胞数量明显多于正常对照组，并且随着PCE的浓度增加，凋亡的细胞数逐渐增多。当不同浓度的PCE作用于MCF7细胞后，细胞凋亡率明显高于正常对照组，随着剂量的增加，细胞凋亡率明显增加。见表1。

与正常对照组比较，150、200、250、300 μg/L的PCE作用后显著抑制了MCF7细胞的迁移能力，且呈浓度依赖性(图4)，当PCE的浓度到达200 μg/L时，MCF7细胞的迁移能力下降了50%左右。

3 讨论

癌症是以细胞异常增殖及转移为特点的疾病，是导致人类死亡的主要疾病之一，乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，严重危害了妇女的生命健康，通过摄入有抗癌活性的食物防治乳腺癌是一种简单经济、效果明显的方法[6-7]。天然食物是化学预防药物的最好来源之一，这些来源于食物的天然成分生理作用比较缓和，几乎无毒，可以较长期服用[8-9]。紫甘蓝富含多种营养成分和植物色素，但对其抗癌作用的研究鲜有报道，本研究分别考察了紫甘蓝浓缩汁液对乳腺癌细胞MCF7的增殖、形态、凋亡和迁移的影响。紫甘蓝对MCF7细胞的体外抑制试验采用的是MTT法，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，可间接反映活细胞数量，并且灵敏度较高[10]，MTT试验结果表明，PCE能够有效抑制MCF7细胞增殖，细胞抑制率呈浓度、时间依赖性，对细胞形态的观察也进一步的表明PCE对MCF7细胞有损伤和抑制作用。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡，其意义在于能消除在形成过程中发生异常的细胞，然而在抑癌基因p53出现问题时，就不会诱导凋亡发生，从而导致癌细胞的不断增长，采用Annexin V-FITC/PI法可以区分凋亡早期、凋亡晚期和死亡细胞，灵敏度高[11]。细胞凋亡试验结果表明，PCE能诱导MCF7细胞凋亡，这很有可能是导致MCF7细胞形态发生改变以及抑制MCF7细胞增殖的原因。癌细胞转移是恶性肿瘤致死的主要原因，肿瘤细胞的转移是多因素、多步骤的过程，其中肿瘤细胞的迁移能力被认为是肿瘤转移的限速环节，肿瘤细胞的迁移能力与其转移潜能呈正相关性[12]。在本研究中，用Transwell法观察了PCE对MCF7细胞迁移的影响，Transwell小室置于培养板中，Transwell小室内称上室，培养板内称下室，上室盛装细胞培养液，下室盛装细胞诱导液，上下层液体以PET膜相隔，将MCF7细胞种在上室内，由于PET膜的通透性，下层迁移液的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对MCF7细胞迁移的影响[13]。Transwell实验结果显示，PCE对MCF7细胞迁移有明显的抑制作用，并且呈浓度依赖性。这些实验结果提示紫甘蓝具有潜在的抗癌价值。

紫甘蓝属于十字花科甘蓝类植物，在200多项流行病学研究资料中，有80%的结果表明食用植物性食物特别是十字花科蔬菜能够降低多种癌症的患病风险，其中甘蓝类植物对癌症的预防作用更是强于其他蔬菜和水果[14-15]。十字花科植物所含有的硫代葡萄糖苷(硫苷)的水解产物是其抗癌特性的主要成分，硫苷自身性质比较稳定，不具备生物活性，但是它可以被内源性黑芥子酶或人肠道内微生物产生的水解酶水解，生成硫氰酸盐、异硫氰酸盐、腈类等一系列活性物质，异硫氰酸盐对哺乳动物的肝癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌有明显的抑制作用[16-18]。研究表明，紫甘蓝含有脂肪族硫苷、吲哚族硫苷、芳香族硫苷等，除了含有硫苷外，还富含花青素，花青素是一种天然色素，可以清楚自由基，有很强的抗氧化功能，其降解产物在减轻疼痛和预防癌症方面也有一定的功效[19-20]。因此，我们推测紫甘蓝的抗癌活性与其富含的硫苷和花青素有关，但是具体是哪些物质发挥了抗癌活性，以及紫甘蓝的抗癌机制还有待进一步研究。

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PurpleCabbageExtractinInhibitionofBreastCancerCellGrowthandMigration

Xu Yingqian,Zeng Xue,Tang Qian

(CollegeofPharmacy,ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing401331,China)

Objective:To investigate the effect of purple cabbage extract (PCE) on breast cancer cell MCF7 growth and migration.MethodsThe inhibition rate of MCF7 cells was assessed by MTT method,and the inverted phase contrast microscope was used to observe the cellular shape.Flow cytometry was utilized for measuring cell apoptosis after Annexin V-FITC/PI stained the cell.The transwell chamber was used to investigate cell migration.ResultsPCE inhibited MCF7 cell proliferation in a concentration-and time-dependent manner (P<0.05).After incubated with PCE,the cells became shrinkage and turned round,arranged loosely and adhered not favorable gradually.PCE induced MCF7 cell apoptosis and inhibited cell migration in a concentration-dependent manner (P<0.05).ConclusionPCE inhibits breast cancer cell MCF7 growth and migration.

Purple cabbage；Breast cancer；Cell proliferation；Cell apoptosis；Cell migration

重庆医药高等专科学校科研计划项目(ygz2015107)

徐颖倩(1989.04—)，女，硕士，讲师，研究方向：药物化学，E-mail：alicexu0410@126.com

唐倩(1979.02—)，女，硕士，副教授，副院长，研究方向：药物分析，E-mail：15981934@qq.com

R151.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.054

(2016-12-29收稿 责任编辑：杨觉雄)