糖肾方的高效液相指纹图谱研究Δ

何洁英，王汝上

(1.佛山市第一人民医院/中山大学附属佛山医院药学部，广东 佛山 528000； 2.广州康臣药物研究有限公司研发部，广东 广州 510530)

糖肾方的高效液相指纹图谱研究Δ

何洁英1*，王汝上2#

(1.佛山市第一人民医院/中山大学附属佛山医院药学部，广东 佛山 528000； 2.广州康臣药物研究有限公司研发部，广东 广州 510530)

目的：建立糖肾方的高效液相指纹图谱分析方法，为该药的质量控制提供依据。方法：采用Aglient C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、二极管阵列检测器，以甲醇-0.2%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，检测波长为260 nm。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)”对指纹图谱进行相似度评价。结果：建立了糖肾方的指纹图谱，确认了22个共有峰。经相似度评价，10批糖肾方的相似度均>0.99。结论：本研究建立的方法稳定可靠、重复性好，可为糖肾方的质量控制提供依据。

糖肾方； 高效液相色谱； 指纹图谱; 总黄酮

*主管药师。研究方向：药物分析。E-mail：hjieying@fsyyy.com

#通信作者：研究工程师。研究方向：新药研究。E-mail：resun-com@163.com

糖肾方是源于古方黄耆散的加味方。黄耆散最早出自北宋《圣济总录》(第五十九卷·消渴门·渴利)：“治三消渴疾，肌肤瘦弱，饮水不休，小便不止。黄耆(锉)、桑根白皮(锉细各一两)、葛根(锉二两)，上三味，捣罗为散，每服三钱匕，煎燖猪汤，澄清调下，不拘时”[1]。糖肾方由黄芪、葛根、桑白皮和茯苓等4味药组成，在长期的临床实践中无不良反应的记载或报道，且大量临床及基础研究结果表明糖肾方及方中各药对糖尿病及糖尿病肾病具有良好的疗效[2-5]。糖肾方具有改善糖、脂代谢和血液流变，对抗胰岛素抵抗[6-9]、氧化应激、凋亡和炎症[10-13]，降低尿蛋白，保护肝脏、肾脏和胰腺等作用[14-17]，可能通过多途径、多靶点发挥药效。糖肾方已广泛用于临床，但目前尚无科学合理的质量控制方法。本研究建立了糖肾方的高效液相指纹图谱分析方法，为有效、全面控制糖肾方的质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器

安捷伦1260型液相色谱仪、DAD检测器(美国安捷伦科技公司)；Millipore超纯水系统(广州东锐科技有限公司)；BT-125D型电子天平(Sartorius公司)；中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)。

1.2 药品与试剂

糖肾方(广州康臣药物研究有限公司提供10批中试研究样品，批号：S1—S10)；甲醇(Merck公司)、甲酸(Merck公司)均为色谱纯，其他试剂为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液：取糖肾方处方药材各10 g，精密称定，加8倍量70%乙醇回流提取3 h，过滤，置于1 000 ml容量瓶中，加入相同溶剂定容，经微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.2 对照组溶液：取葛根素对照品适量，精密稳定，置于100 ml容量瓶中，加30%乙醇溶解定容至刻度(0.169 mg/ml)，作为葛根素对照品储备液。再取储备液适量制成每1 ml含有42.25 μg的对照品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液：按处方比例及制备方法，制备不含黄芪、葛根、桑白皮和茯苓药材的样品，并按照“2.1.1”项下方法制备阴性对照溶液。

2.1.4 阳性对照溶液：按处方比例及制备方法，制备只含黄芪、葛根、桑白皮和茯苓药材中的1味药材的样品，并分别按照“2.1.1”项下方法制备阳性对照溶液A、B、C及D。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱(洗脱程序见表1)，检测波长为260 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μl。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution procedures

2.3 提取溶剂考察

取糖肾方处方药材各10 g，共5份，精密称定，分别采用40%、50%、60%、70%和80%的乙醇进行提取，再按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。结果表明，70%乙醇的提取效率最好，特征峰面积总和最大，各特征峰分离度最好。

A.40%乙醇；B.50%乙醇；C.60%乙醇；D.70%乙醇；E.80%乙醇 A. 40% ethyl alcohol; B. 50% ethyl alcohol; C. 60% ethyl alcohol; D. 70% ethyl alcohol; E.80 % ethyl alcohol图1 不同提取溶剂提取的糖肾方的高效液相色谱图Fig 1 HPLC of Tangshen formula extracted from different solvent

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验：取同一批糖肾方(批号：S1)处方中药材适量，按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，进样量为10 μl，记录色谱图。结果表明，6张色谱图相似度均>0.999，各共有峰的相对保留时间及峰面积的RSD均<0.5%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验：取同一批糖肾方(批号：S1)处方中药材适量，按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，放置0、4、8、12、16、24和48 h后按照“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果表明，7张色谱图相似度均>0.999，各共有峰的相对保留时间及峰面积的RSD均<1.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验：取同一批糖肾方(批号：S1)处方中药材适量，按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液6份，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果表明，6张色谱图相似度均>0.999，各共有峰的相对保留时间及峰面积的RSD均<1.0%，表明本方法的重复性良好。

2.5 糖肾方指纹图谱的建立及相似度计算

2.5.1 糖肾方指纹图谱的建立：取10批糖肾方处方药材，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以糖肾方(批号：S1)作为对照，生成10批指纹图谱，见图2。

2.5.2 主要色谱峰的指认：结合10批样品的相似度，标定22个共有特征峰，见图2。取“2.1.2”项下对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将图2与对照品溶液色谱图进行比较，确定5号峰为葛根素峰，其他色谱峰的指认有待进一步研究确认。

2.5.3 相对保留时间和相对峰面积：以5号峰(葛根素)为参照峰，计算22个共有峰的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD。结果显示，22个共有峰的相对保留时间的RSD均<0.2%，相对峰面积的RSD为0.826%～40.153%,表明10批糖肾方样品间相对保留时间的差异较小，相对峰面积的差异较大，见表2—3。

图2 10批糖肾方高效液相指纹图谱Fig 2 HPLC fingerprinting of 10 batches of Tangshen formula

表2 10批糖肾方22个共有峰的相对保留时间Tab 2 Relative retention time of 22 common peaks of 10 batches of Tangshen formula

2.5.4 共有峰的药材归属：取“2.1”项下供试品溶液，阴性对照溶液和阳性对照溶液A、B、C及D，按照“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并将保留时间一致、阴性对照溶液色谱图中未出现且紫外吸收相同的色谱峰进行比较，确定特征峰的药材归属，结果见表4。

2.5.5 相似度评价：采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)”软件，对10批糖肾方指纹图谱和生成的对照指纹图谱的相似度进行评价。结果表明，10批糖肾方的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均>0.99，见表5。

3 讨论

随着中药现代化的要求越来越高，中药指纹图谱已广泛应用于中药的质量控制。指纹图谱的最大特点是可在不清楚所有化学成分的情况下进行质量控制，从而提高药物的稳定性及疗效[18]。本研究采用高效液相色谱法建立糖肾方的指纹图谱分析方法，经过方法学考察，表明本方法具有操作简单、重复性好和专属性强的优点，可用于糖肾方的质量控制。

本研究曾对色谱条件进行考察。(1)流动相考察：考察了不同浓度的乙腈-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液及甲醇-甲酸水溶液等不同体系的梯度洗脱系统。结果表明，以甲醇-0.2%甲酸水溶液梯度洗脱时，特征峰明显，分离效果最好。因此，本研究选择的流动相为甲醇-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱，洗脱时间为85 min。(2)检测波长考察：取供试品溶液适量，根据色谱条件在DAD检测器进行190～400 nm的全波长扫描。结果表明，大多数成分在波长260 nm处有较大吸收，且主要色谱峰分离效果较好、基线平稳，故确定检测波长为260 nm。(3)柱温考察：分别考察了柱温25、30和40 ℃时对色谱分离度的影响。结果表明，相较于25 ℃，柱温30 ℃的分离效果好，保留时间适宜；而柱温30、40 ℃时的保留时间和分离效果差异不大，为节约成本和保护色谱柱，最终选择柱温为30 ℃。

表3 10批糖肾方22个共有峰的相对峰面积Tab 3 Relative peak area of 22 common peaks of 10 batches of Tangshen formula

表4 高效液相指纹图谱特征峰的药材归属Tab 4 HPLC fingerprint characteristic peak of the medicinal materials

在提取溶剂的选择上，本研究曾采用薄层色谱法考察不同浓度的甲醇、乙醇和水等溶剂提取糖肾方有效成分。结果显示，以甲醇和乙醇提取的糖肾方有效成分(总黄酮)斑点数明显多于水提取的，且相同浓度的甲醇和乙醇提取的斑点大小和数量基本一致，表明醇的总黄酮提取率比水高，故选择甲醇或乙醇作为提取溶剂。而考虑到成本、环保和安全性，最终选择乙醇作为提取溶剂，并进一步考察了不同浓度乙醇对提取结果的影响，最终选择70%乙醇作为糖肾方总黄酮的提取溶剂。

表5 10批糖肾方指纹图谱相似度结果Tab 5 Similarity evaluation of HPLC fingerprinting of 10 batches of Tangshen formula

综上所述，本研究建立了糖肾方的高效液相指纹图谱分析方法，可用于糖肾方的质量控制；并采用“中药材指纹图谱相似度评价软件”评价指纹图谱的相似度，简便、快捷，可为糖肾方及其他中药方剂的临床应用和质量控制提供依据。

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ResearchonHighPerformanceLiquidChromatographyFingerprintingofTangshenFormulaΔ

HE Jieying1, WANG Rushang2

(1.Dept.of Pharmacy, the First People’s Hospital of Foshan/Affiliated Foshan Hospital of Sun Yat-sen University, Guangdong Foshan 528000, China; 2.Dept.of Research and Development, Guangzhou Consun Drug Research Ltd., Guangdong Guangzhou 510530, China)

OBJECTIVE: To establish the method of high performance liquid chromatography(HPLC)fingerprinting of Tangshen formula, so as to provide basis for the quality control. METHODS: Aglient C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) column and diode-array detector were adopted, methanol-0.2% formic acid aqueous solution was set as mobile phase to conduct gradient elute. The flow rate was 1.0 ml/min, detection wavelength was 260 nm. Similarity evaluation was conducted according to “Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (Version 2004A)”. RESULTS: HPLC fingerprinting of Tangshen formula was established, 22 characteristic peaks were determined. After similarity evaluation, the similarity of 10 batches of Tangshen formula were >0.99. CONCLUSIONS: The method is stable and reliable with a good reproducibility and can provide basis for the quality control.

Tangshen formula; HPLC; Fingerprints; Total flavonoids

R927.1

A

1672-2124(2017)11-1464-05

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.11.007

广东省科技计划项目(No.2011A080504005)

2017-02-08)