胶原蛋白海绵对大鼠股主静脉创伤止血效果及组织相容性观察

张自强，张以河，安 琪，赵继志，徐荣荣，李 欢

胶原蛋白海绵对大鼠股主静脉创伤止血效果及组织相容性观察

张自强，张以河，安 琪，赵继志，徐荣荣，李 欢

目的建立SD大鼠股主静脉创伤出血动物模型，观察胶原蛋白海绵的止血效果及组织相容性和生物降解率。方法SD大鼠21只用于建立股静脉出血创面模型，分为艾瑞金组9只、阳性对照组9只、空白对照组3只。将止血材料置于大鼠的腿部静脉出血创面，记录各组的止血时间及出血量。大鼠股静脉出血创面7、14、28 d时间点解剖探查，切取创面组织，进行病理组织检查，观察光镜下组织反应。结果对应股主静脉出血创面，艾瑞金组、阳性对照组及空白对照组均可止血。艾瑞金组与阳性对照组比较止血时间及失血量差异均无统计学意义(P＞0.05)。艾瑞金胶原蛋白海绵7 d开始降解、14 d部分降解、28 d完全降解。结论艾瑞金胶原蛋白海绵对静脉出血止血效果明显，组织相容性好，能够促进静脉创口愈合。

胶原蛋白海绵；止血；股主静脉

战争、车祸及其他事故造成的不可控大出血是死亡的重要原因[1]。血液的大量流失往往危及生命，同时出血或渗血也会增加感染的风险，尽快地控制出血是降低死亡率的最佳策略[2]。在实质性脏器血管薄脆的病变组织如肿瘤、拔牙等手术中，依靠常规的止血方法如人工挤压和伤口缝合有时不能有效止血，必须依赖于辅助止血剂的配合使用[3]。目前可吸收止血材料在临床中已大量应用，具有不同的止血机制与适用范围，如多糖类、可吸收明胶海绵、硅藻盐类、胶原蛋白等[4]。多数是通过物理作用止血，机制为创面血液中的血小板凝集在止血材料上，形成凝胶状物质，凝结成血块，从而达到止血的目的[5]。而单纯的物理性止血材料还存在止血效果不理想、黏附性差易脱落、具有炎性反应等问题[6]。因此，兼具物理与生物功能止血材料的研发成为国内外医药科研人员关注的焦点。胶原蛋白止血材料是生物止血材料领域的重大进展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司，实验动物许可证号SCXK-(京)-2012-0004；共选取健康成年SD大鼠21只，体重180～210 g，雌雄不限，单笼喂养，自由饮水进食，在实验室饲养1周后进入实验，分为艾瑞金组9只、阳性对照组9只、空白对照组3只。

1.1.2 仪器、设备、实验材料 实验器材有解剖台、手术刀具、镊子、医用消毒纱布、天平、钢直尺、秒表、电动剃须刀、不同规格一次性注射器、塑料盒、采血管、手术衣。试剂有3%戊巴比妥钠溶液、碘尔康、医用酒精。艾瑞金组:艾瑞金胶原蛋白海绵，北京湃生生物科技有限公司，批号20160519；阳性对照组:胶原蛋白海绵，国家食品药品监督管理总局已批准的市售医用胶原蛋白海绵，批号160373-01；空白对照组:精确称重的无菌医用纱布块。

1.2 方法

1.2.1 术前准备 手术器材灭菌消毒。艾瑞金胶原蛋白海绵、阳性对照胶原蛋白海绵、无菌医用纱布准确称重，实验动物手术前1 d禁食、不禁水。

1.2.2 手术方法 将大鼠用3%戊巴比妥钠30 mg/kg经腹腔注射麻醉，俯卧位固定于解剖台上，用电动剃须刀剃去大鼠右大腿部毛发，碘尔康液消毒，铺巾。切开皮肤，游离解剖出股主静脉后用尖头刀挑断，形成大小约2 cm×1 cm的出血创面；创口形成后10 s内用已精确称重的纱布块吸走喷出血液，直至血液不再大量涌出，分别将2 cm×1 cm×0.5 cm止血材料敷在伤口上并用手指轻轻按压，开始记录时间；待胶原蛋白海绵能较好敷在创口后，手不再按压，以不再出血、渗血为止血标准，停止记录时间，记录止血时间，取下胶原蛋白海绵称重计算术中的出血量，然后创口再填充1片新的胶原蛋白海绵。出血量(g)＝(止血后材料重量＋擦拭血液干纱布的重量)－(止血前止血材料重量＋干纱布的重量)。艾瑞金组、阳性对照组术后将止血材料直接进行包埋，缝合创口，单笼饲养，自由饮水进食。空白对照组采用医用纱布加压止血，术后无材料填充。

1.2.3 观察胶原蛋白海绵组织相容性和降解情况术后7、14、28 d检测血常规后将大鼠进行安乐死。首先观察皮肤创口愈合情况，然后观察静脉创口愈合情况及止血材料降解情况。取出创伤部位组织，用甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片，行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，在光镜下观察填充包埋在静脉创口处胶原蛋白海绵降解及周围组织炎性反应情况，并行血常规检查，以此研究胶原蛋白海绵的止血效果及组织相容性。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0软件，计量资料以均数±标准差(¯x±s)表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 止血材料使用操作性能 术中发现胶原蛋白海绵置于出血创面后，艾瑞金组柔韧性良好，使用过程中易于弯折，修剪过程中无颗粒或碎屑掉落；黏附性好，不需器械辅助即可在短时间内迅速吸收血液或体液，与创面紧密贴合，吸液后海绵变软、缩小，止血效果明显。阳性对照组柔韧性较艾瑞金组差，在修剪过程中易碎，有大量材料颗粒掉落。艾瑞金组胶原蛋白海绵在操作柔韧性、组织黏附性等方面均优于阳性对照组。

2.2 材料的止血性能及血液检查

2.2.1 止血时间 艾瑞金组、阳性对照组、空白对照组的创面止血时间分别为(105.4±62.9)、(146.3±123.5)、(67.3±34.0)s。艾瑞金组比阳性对照组止血所用时间短，但差异无统计学意义(F＝0.483、P＝0.497)；艾瑞金组、阳性对照组与空白对照组比较，止血时间差异均无统计学意义(F分别为0.732、0.801，P分别为0.412、0.392)。见表1。

2.2.2 出血量 艾瑞金组、阳性对照组、空白对照组的股主静脉出血量分别为(0.450±0.28)、(0.914±0.78)、(0.151±0.03)g。艾瑞金组比阳性对照组出血量少，但差异无统计学意义(F＝2.881、P＝0.109)。艾瑞金组、阳性对照组与空白组比较，止血时间差异均无统计学意义(F分别为3.187、2.716，P分别为0.104、0.130)。见表1。

表1 大鼠股静脉创面失血量和止血时间

2.2.3 各组不同时间点血常规检测 7 d艾瑞金组与阳性对照组血小板计数比较差异有统计学意义(F＝14.545、P＝0.001)；阳性对照组与空白对照组的白细胞计数比较差异有统计学意义(F＝9.913、P＝0.009)。14 d艾瑞金组、阳性对照组与空白对照组血红蛋白比较差异均有统计学意义(F分别为15.757、57.012，P分别为0.007、0.000)，阳性对照组与空白对照组红细胞计数比较差异有统计学意义(F＝27.495、P＝0.002)。28 d艾瑞金组与阳性对照组的白细胞计数、血红蛋白、红细胞计数、血小板计数比较差异均无统计学意义(F分别为0.971、0.810、0.971、0.083，P分别为0.370、0.409、0.309、0.785)。见表2。

表2 术后各组不同时间点血常规检测

2.3 止血材料降解组织学表现

2.3.1 创面愈合过程大体观察 大鼠大体观察，术后各组动物都存活且状态良好。

2.3.1.1 艾瑞金组 术后7 d，大鼠皮肤创口愈合良好(图1A)，无血肿、无炎性反应现象。股静脉创口愈合良好，填充部位未见明显的炎症反应。填充的止血材料呈胶状，保持填充时形态，未发生位移。术后14 d，大鼠皮肤创口完全愈合，留下一条线状瘢痕(图1B)；静脉创口完全愈合，无血肿、无炎性反应。止血材料呈淡黄色凝胶状，部分降解。术后28 d，胶原蛋白海绵完全降解，皮肤创口愈合良好，创口平整瘢痕消失(图1C)。

2.3.1.2 阳性对照组 与艾瑞金组情况类似。术后7 d皮肤创口开始愈合(图1D)，止血材料被结缔组织包裹；术后14 d创口形成瘢痕组织(图1E)，止血材料部分降解；术后28 d创口完全愈合瘢痕消失(图1F)，止血材料完成降解。

2.3.1.3 空白对照组 术后7 d，皮肤创口裂开、红肿(图1G)，静脉创口处有淤血，形成血凝块。术后14 d皮肤创口愈合、瘢痕组织明显(图1H)；解剖发现静脉愈合不良，有大量淤血形成血肿。

2.3.2 解剖情况及光镜下组织学表现 艾瑞金组病理:术后7 d填充的止血材料被周围结缔组织完整包裹(图2A)，结缔组织较薄呈条索状；结缔组织内有大量的炎性细胞(图3A)，包含新生的毛细血管、条索状的不同成熟期的成纤维细胞。术后14 d止血材料外周结缔组织成分较为成熟且分解(图2B)，方向一致，可见大量嗜中性粒细胞与多核巨噬细胞(图3B)。术后28 d镜下未见止血材料完全降解(图2C)，多见条索状排列的纤维细胞(图3C)，部分纤维组织排列较为疏松；组织内有大量上皮样细胞、淋巴样细胞、新生毛细血管、肥大细胞及多核巨噬细胞。

图1 创面愈合大体情况

阳性对照组病理情况与艾瑞金组相似:术后7 d材料开始降解(图2D)被炎性细胞浸润(图3D)；术后14 d止血材料呈絮状(图2E)，巨噬细胞增加(图3E)；术后28 d镜下未见止血材料组织(图2F)，结缔组织更加成熟，毛细血管增加(图3F)。

空白对照组:术后7 d镜下可见新生组织内细胞排列紊乱，大量出血区域形成血肿(图2G)，大量炎性细胞浸润(图3G)；术后14 d创口愈合不良，结缔组织内有血肿现象(图2H)，组织间多见中性粒细胞吞噬红细胞后产生含铁血黄素的巨噬细胞(图3H)。

图2 解剖情况

图3 病理切片观察(HE，×100)

3 讨论

胶原蛋白是一种纤维蛋白，伸张能力强，是韧带和肌腱的主要成分，对皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨等的形成十分重要[7]。在愈合伤口、纤维化组织、肿瘤组织中合成[8]，在止血过程中，能够为细胞的黏附、运动、增殖和生物降解提供适宜的微环境；同时，可防止水分与体液的流失，具有很好的亲和性和黏合力，能够促使毛细血管形成，加速肉芽组织生长，缩短创面愈合的时间，加速损伤组织的愈合，促进痊愈[9]。胶原蛋白的生物特性使其在组织工程与再生医学中具有广泛应用[10]。

鲁瑶[11]将胶原蛋白海绵应用于甲状腺手术中止血，与空白对照组相比手术残腔出血量明显减少，说明胶原蛋白海绵不仅对甲状腺残腔具有很好的填充修复作用，而且还能明显减少术后血肿、感染等并发症。刘宇等[12]在上颌骨囊肿摘除术中应用浸有地塞米松的医用胶原蛋白海绵填塞术腔，有效降低了患者的疼痛与创口处肿胀程度。闫铭等[13]在股骨近端抗旋髓内钉取出术中应用胶原蛋白海绵填充骨钉取出后的钉道空腔，结果证明胶原蛋白海绵可以明显降低术后失血量，填充创口促进愈合。Bergman等[14]采用胶原蛋白海绵治疗微创手术过程中出现的急性左心室壁破裂，避免缝合过程中脆弱的心肌组织发生破裂。Lewis等[15]将胶原蛋白与N-羟基丁二酰亚胺共同组合而成的止血辅料应用于凝血障碍的患者，使用方便，止血效果良好。

本研究比较了艾瑞金胶原蛋白海绵与阳性对照医用胶原蛋白海绵，发现两者对于静脉创口均有很好的止血效果，2组间的止血时间和失血量均无显著性差异。虽然2组止血时间长于空白对照组、且失血量也大于空白对照组，但差异均无统计学意义(P＞0.05)。这可能是空白对照组样本量不足，同时创口缝合后再次出血，形成淤血或血肿，判断空白对照组形成的止血效果为假性止血。而艾瑞金组、阳性对照组能有效防止创口再次出血，预防淤血及血肿的发生。胶原蛋白海绵疏松多孔的结构有利于细胞黏附[16]，促进细胞在结缔组织上的黏附、移动、生长和沉积；能诱导成纤维细胞的趋化性，加速创伤修复[17]。研究发现，黏附能力强的止血材料在创面能起到一定的压迫止血作用，止血效果增加[18]。手术过程中，艾瑞金胶原蛋白海绵相对于阳性对照胶原蛋白海绵黏附性更佳。阳性对照胶原蛋白海绵在修剪过程中易碎，手术剪切时产生大量碎屑，止血过程中对创口的黏附性不良，易滑落，需用镊子等器械辅助按压才能很好贴合。艾瑞金胶原蛋白海绵韧性良好，修剪过程中无碎屑产生，止血过程中黏附性良好，一接触血液便迅速吸血变软，并紧密黏附在创口，无需任何器械辅助。

综合大鼠腿部静脉创口愈合观察结果，艾瑞金胶原蛋白海绵与出血创面黏附性良好，组织相容性好，体内可快速降解，不会引起机体炎性反应。与空白对照止血材料比较，胶原蛋白海绵作为止血、填充材料能够促进皮肤与静脉创口愈合，有效防止淤血、血肿等二次创伤情况的发生。

综合病理切片分析，胶原蛋白海绵填充后，能够促进伤口愈合，有效地止血并防止淤血、血肿情况发生，具有良好的组织相容性，体内可自行降解，不会引起机体炎性反应。

通过本研究可得出:①艾瑞金胶原蛋白海绵能紧密贴附封闭创面，促进创口愈合；②对于静脉出血可发挥良好的止血性能，止血效果与阳性对照胶原蛋白海绵相当，但柔韧性更佳、黏附性强；艾瑞金胶原蛋白海绵不会引起炎性反应、组织相容性好、生物降解快，与空白对照止血材料比较，可以促进伤口愈合，并有效防止静脉创口再次出血，避免血肿发生；③止血材料降解过程中会被新生结缔组织包裹，在临床应用中起到填充的作用，可用于组织的止血和腔隙填充，比如拔牙术后填充既能有效止血又能促进牙龈组织再生，防止萎缩，也可用于骨组织固定物拔出后的止血填充或人工骨修复材料填充后的材料表面覆盖和隔离。

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Hemostatic effect and histocompatibility of collagen sponge on the trauma surface in rats

ZHANG Ziqiang1，ZHANG Yihe1，AN Qi1，ZHAO Jizhi2，XU Rongrong3，LI Huan3

(1.Beijing Key Laboratory of Materials Utilization of Nonmetalic Minerals and Solid Wastes，School of Materials Science and Engineering，China University of Geosciences(Beijing)，Beijing 100083，China；2.Department of Stomatology，Peiking Union Medical College Hospital，Beijing 100730，China；3.Beijing Pashion Biotech Co.，Ltd，Beijing 102200，China)

ObjectiveTo study the hemostatic effect and the biocompatibility of the collagen on a groin wound by means of rat models.MethodsCreating trauma surface bleeding models in 21 SD rats.The rats were classified into 3 groups:group using iRegene collagen sponge included 9 rats，positive control group using medical collagen sponge included 9 rats，and control group included 3 rats.The time and the amount of hemorrhage on the groin wounds were observed.The materials left in the groin models were collected by killing the animals 7 d，14 d and 28 d postoperatively to examine the speed of absorption and histological changes introduced by the hemostatic agents.ResultsBleeding was stopped on the surface of groin wounds.There was no significant difference in the hemostatic ability between group iRegene collagen sponge and positive control group(P＞0.05).The materials left on the hepatic wound 7 d postoperative produced little histological changes and the iRegene collagen sponge was partial degraded and absorbed at 14 d，at 28 d it was totally degraded and absorbed.ConclusioniRegene collagen sponge possesses a good hemostatic effect on wound produced venous bleeding，it shows better histocompatibility and a faster degradation and could be a more potential hemostatic agent.

Collagen sponge；Hemostatic；Femoral vein

R331.6－332

A

2095-3097(2017)06-0350-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.06.008

北京市科技计划专项课题(Z16010101427)

100083北京，中国地质大学(北京)材料科学与工程学院非金属矿物与固废资源材料化利用北京市重点实验室(张自强，张以河，安 琪)；100730北京，北京协和医院口腔科(赵继志)；102200北京，北京湃生生物科技有限公司(徐荣荣，李 欢)

本实验采用的艾瑞金胶原蛋白海绵以牛跟腱为原料，采用酶解、透析、冻干、灭菌等工艺得到去端肽胶原蛋白。酶解过程去除了胶原蛋白分子C端和N端非螺旋区域的免疫原性端肽，使得胶原支架材料的免疫原性进一步降低。本研究已通过国家食品药品监督管理总局的理化性能和生物相容性评价检测。本实验通过胶原蛋白海绵对大鼠股主静脉失血模型作用效果的研究，以证明艾瑞金胶原蛋白海绵在股静脉止血、填充及促进伤口愈合领域的作用效果，以期确定胶原蛋白海绵在止血领域临床应用中的安全性和有效性。

2017-06-08 本文编辑:徐海琴)