二氢杨梅素通过抑制胰岛素样生长因子1受体下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号途径增强赫赛汀对乳腺癌细胞的抑制作用

张明亮，潘成武，王 岗，金功圣，钱 军

·基础研究·

二氢杨梅素通过抑制胰岛素样生长因子1受体下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号途径增强赫赛汀对乳腺癌细胞的抑制作用

张明亮，潘成武，王 岗，金功圣，钱 军

目的观察胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB)信号激活对赫赛汀敏感性的影响，探讨二氢杨梅素(dihydromyricetin，DMY)增强赫赛汀敏感性的机制。方法大剂量胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)作用乳腺癌SKBR3细胞，激活IGF1R及其下游PI3K/PKB信号通路。分别给予赫赛汀、DMY、DMY联合赫赛汀作用，Western Blot检测细胞受体分子IGF1R、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)及下游信号蛋白胰岛素受体底物1(insulin receptor substrates 1，IRS1)、PKB、第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten gene，PTEN)表达及磷酸化水平变化；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法、流式细胞仪和Transwell小室侵袭实验分别检测肿瘤细胞增殖活性、凋亡及侵袭性变化。结果亲代SKBR3细胞经大剂量IGF1作用后，细胞内IRS1磷酸化水平显著升高(P＜0.01)，PKB磷酸化水平先缓慢上升、后逐渐平稳，PTEN表达水平显著下降差异有统计学意义(P＜0.01)；DMY可以显著降低细胞内IRS1(P＜0.01)及PKB(P＜0.01)磷酸化水平，提高PTEN表达水平(P＜0.01)；DMY联合赫赛汀作用可显著降低细胞的侵袭能力(P＜0.01)、增强细胞凋亡率(P＜0.01)。结论IGF1激活IGF1R下游PI3K/PKB信号通路可能是导致SKBR3细胞对赫赛汀产生耐药的原因之一，DMY能够通过抑制PI3K/PKB信号途径增强赫赛汀的敏感度。

二氢杨梅素；赫赛汀；人表皮生长因子受体2；胰岛素样生长因子1受体；信号通路

人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)过表达型乳腺癌约占整个乳腺癌分子分型的30%左右，此类肿瘤恶性度高、侵袭性强，容易发生复发和转移[1]。靶向药物赫赛汀(herceptin)是一种人源化单克隆抗HER2抗体，可以有效地与肿瘤细胞HER2结合，阻止HER2下游信号的传导，抑制乳腺癌细胞的增殖和转移，已广泛应用于临床。然而其耐药性发生率较高，目前已明确胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)的下游信号通路磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB)与HER2的下游信号通路重叠，IGF1R的异常激活是导致抗HER2治疗失败的重要原因之一，抑制IGF1R的过度激活是一种有效恢复赫赛汀敏感性的可行方案[2]。最近研究发现，纯天然黄酮类化合物二氢杨梅素(dihydromyricetin，DMY)具有显著抗肿瘤效应，其可以促进抑癌基因第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten gene，PTEN)的表达，抑制肿瘤细胞增殖[3-4]；且联合化疗应用时，可以增加化疗药物的疗效[5-7]。那么，DMY联合赫赛汀治疗，是否具有协同疗效目前尚鲜见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人乳腺癌SKBR3细胞株(上海奥陆生物科技有限公司)。

1.1.2 主要药品与试剂 DMY(南京景竹生物科技有限公司)，赫赛汀(瑞士Roche公司)，达伯尔改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM，中国赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，IGF1、IGF1R抗体、HER2抗体、胰岛素受体底物1(insulin receptor substrates 1，IRS1)及磷酸化IRS1抗体、PKB及磷酸化PKB抗体、PTEN抗体(中国Boster公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]试剂盒(日本Amresco公司)，二辛可宁酸蛋白定量盒(碧云天生物科技研究所)，单抗与二抗(中国Boster公司)。

1.1.3 主要仪器 二氧化碳细胞培养箱(中国Forma Scientific公司)，离心机(中国Hema医学仪器生产有限公司)，流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)，显微镜(日本OLYMPUS)，酶标仪(德国莱卡公司)，凝胶图像分析系统(美国Ultra-Violet Products公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌SKBR3细胞株从液氮取出后，1 min内连同冻存管一并放置于温水(37℃)中复苏，直至冻存管内冻存液完全溶解后，置于离心机以1 000 r/min离心5 min。再置于超净工作台，弃去冻存管内上清冻存液，向管内加入含10%胎牛血清的完全培养液5 mL轻轻吹打至均匀后，转移至25 cm2培养瓶中，将培养瓶置于含有5%CO2的37℃培养箱。48 h后更换细胞培养液，培养液中含有IGF1 100 ng/mL。根据细胞培养情况，间隔2～3 d更换培养液或传代。

1.2.2 Western Blot检测 分别经过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶的制备、细胞样本上样、电泳(1～1.5 h)、转聚偏二氟乙烯膜、抗体封闭、一抗、洗膜、二抗、洗膜、显影等步骤，分别给予IGF1(1 mg/mL)、DMY(40、80 μmol/L)、赫赛汀(25、50 μg/mL)作用后，测细胞IGF1R、HER2、IRS1、PKB、PTEN的表达及磷酸化状态。

1.2.3 MTT检测细胞增殖抑制率 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，加样至细胞密度1 000～10 000/孔，5%CO237℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入相应浓度药物，孵育16～48 h，倒置显微镜下观察。每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲2～3遍后，再加入含MTT的培养液。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪在490 nm处测量各孔的光密度值。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。分别给予梯度递增的赫赛汀(0、1、2、4、8、16、32、64 μg/L)作用SKBR3及SKBR3-R细胞(经IGF1作用后的SKBR3细胞)，观察对细胞增殖抑制率的影响。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡指数 胰酶消化后，小心收集培养的细胞。用PBS洗涤细胞2次，置于离心机离心，转速2 000 r/min，时间5 min。收集(1～5)×105个细胞，用移液枪向其内加入500 μL结合缓冲液悬浮细胞，再分别加入锚定蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)各5 μL，放置于摇床轻摇以充分混匀。在常温避光环境下，静置反应5～15 min。将样本迅速置于流式细胞仪分析。设置流式细胞仪激发波长，Annexin VFITC通过绿色荧光通道(流式Ex＝488 nm、发射波长Em＝530 nm)检测，PI通过红色荧光(流式Ex＝488 nm、发射波长Em≥630 nm)通道检测。进行荧光补偿调节去除光谱重叠并设定十字门的位置。荧光补偿调节方式以经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照。分别给予DMY(80 μmol/L)、赫赛汀(25、50 μg/mL)作用后，测细胞凋亡情况。

1.2.5 肿瘤Transwell小室迁徙实验 将具有聚碳酸酯膜的Transwell小室(孔径为8 μm)放置在24孔板的孔中。首先利用0.25%胰蛋白酶消化子代SKBR3细胞，以无血清DNEM重悬胰酶消化的细胞，倒置显微镜下计数；将细胞密度为4×104/mL的细胞悬液200 μL接种于Transwell上室中，24孔板孔内置600 μL的含10%PBS DMEM。培养至细胞贴壁生长后，分别用赫赛汀、DMY、赫赛汀＋DMY作用细胞，培养24 h后；将Transwell小室取出，以无菌棉棒轻柔地去除半透膜上表面残留的SKBR3细胞，PBS洗3次；然后利用甲醇和冰乙酸混合液(3∶1)固定30 min，根据Giemsa法染色15 min。轻轻甩掉染液，蒸馏水冲洗3次，在倒置显微镜下计数迁移到半透膜下表面的细胞数量。每组6孔，每孔随机计数6个100×视野内的细胞数，给予DMY(80 μmol/L)、赫赛汀(25、50 μg/mL)作用后，测肿瘤细胞迁徙情况。最后进行统计学分析。

1.3 统计学处理 应用SPSS 18.0软件，计量资料以均数±标准差(¯x±s)表示，组间比较采用t检验、方差分析，GraphPad Prism 5.0作图软件，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SKBR3及SKB3-R细胞对赫赛汀敏感性及细胞周期分布 赫赛汀对亲代SKBR3细胞的半数抑制浓度为1.8 μg/mL，对SKBR3-R细胞半数抑制浓度升至35 μg/mL，两者对赫赛汀敏感性差异有统计学意义(t＝－5.141、P＝0.001，图1)。

图1 梯度递增的赫赛汀作用SKBR3及SKBR3-R细胞后细胞增殖抑制率

2.2 IGF1对SKBR3细胞IGF1R和HER2磷酸化的影响 在SKBR3细胞中IGF1(1 ng/mL)作用30 min后可检测到磷酸化的IGF1R，并且随着时间延长(0、30、60、90、120 min)，IGF1R的磷酸化程度逐渐升高，差异有统计学意义(120 min与0 min比较，t＝2.825、P＝0.048)；而HER2的磷酸化程度始终保持在较平稳的水平，差异无统计学意义(120 min与0 min比较，t＝－1.835、P＝0.14)。见图2A。

2.3 IGF1R激活后下游信号分子IRS1、PKB磷酸化及PTEN表达 随着IGF1作用时间的延长(0、30、60、120 min)，细胞下游IRS1的磷酸化程度随之升高(120 min与0 min比较，t＝11.062、P＝0.001)，PKB磷酸化水平升高后逐渐平稳；而PTEN表达量逐渐降低，差异有统计学意义(F＝263.062、P＝0.004)。见图2B。

2.4 DMY对SKBR3-R细胞IGF1R、HER2磷酸化的影响 DMY(40、80 μmol/L)作用后，IGF1R磷酸化水平显著降低(χ2＝32.84、P＝0.001)，而HER2磷酸化程度无统计学意义(χ2＝0.14、P＝0.707)。见图3。

2.5 DMY联合赫赛汀对SKBR3-R细胞内信号分子IRS1、PKB磷酸化及PTEN表达的影响 DMY联合赫赛汀作用后相比较单纯赫赛汀作用细胞内信号分子IRS1(χ2＝18.84、P＝0.001)、PKB(χ2＝22.04、P＝0.001)磷酸化程度降低明显，而PTEN表达显著升高(χ2＝8.79、P＝0.003)。见图4。

2.6 DMY联合赫赛汀对SKBR3-R细胞的影响相比单一赫赛汀作用，DMY联合赫赛汀有显著促进SKBR3-R细胞凋亡(χ2＝43.67、P＝0.001)、抑制侵袭作用(χ2＝56.79、P＝0.001)。见图5、6。

图2 IGF1对SKBR3细胞的影响

图3 DMY对SKBR3-R细胞IGF1R、HER2磷酸化的影响

图4 DMY联合赫赛汀对SKBR3-R细胞内信号分子IRS1、PKB磷酸化及PTEN表达的影响

图5 DMY联合赫赛汀对SKBR3-R细胞凋亡的影响

图6 DMY联合赫赛汀对SKBR3-R细胞侵袭的影响

3 讨论

IGF1R过表达和激活，以及血清中配体IGF1水平升高在很多肿瘤中存在[8-11]。对伴有HER2过表达的乳腺癌研究发现，IGF1R系统的异常激活是赫赛汀耐药发生的原因之一[12]。IGF1R与HER2有着共同的下游信号传导通路——PI3K/PKB信号通路和Ras-丝裂原活化蛋白激酶信号通路，IGF1R的异常激活，可从旁路激活HER2下游信号通路，导致肿瘤细胞对赫赛汀产生耐药。其中PI3K/PKB介导的信号通路在耐药机制中起主导作用[13]。IRS1是IGF1R作用的底物，IGF1R激活后募集并磷酸化细胞内IRS1，通过磷酸化IRS1继续下游信号的传导。

在本研究中，IGF1作为配体结合IGF1R，IGF1R被激活，细胞周期发生改变，大量细胞进入到S期，分裂增殖旺盛，细胞内信号传导增强，信号蛋白IRS1、PKB磷酸化程度升高，PI3K/PKB信号通路被激活。该信号通路是IGF1/IGF1R系统下游主要信号通路，在肿瘤的发生、发展、抗肿瘤治疗及耐药性的发生过程中起重要作用[14]。此外，IGF1作用后，还可导致细胞内PTEN表达水平下降。PTEN为抑癌基因，在体内主要作用是负反馈抑制PI3K的激活，降低PKB的磷酸化水平，从而起到抑制PI3K/PKB信号通路的作用[15]。PTEN的表达下降也是肿瘤细胞对赫赛汀耐药的重要原因之一[16]。在进一步的研究中发现，DMY能够增加赫赛汀敏感性的另一个重要原因就是其可以促进PTEN的表达，可能与DMY能够抑制细胞核内PTEN转录因子相关的甲基转移酶活性有关[17]。

通过初步的研究发现，DMY至少通过以下方式起到抗肿瘤作用:①抑制由配体IGF1激发的IGF1R的磷酸化，阻碍IGF1R下游PI3K/PKB信号的异常激活。DMY对亲代SKBR3细胞及耐药SKBR3-R细胞增殖均有一定的抑制作用，并随作用浓度的升高，抑制作用加强。其抑瘤作用在其他肿瘤细胞的研究中也得到了论证[5，18]。②DMY可促进PTEN的表达，降低IRS1、PKB磷酸化水平，抑制PI3K/PKB信号通路异常激活。Chakraborty等[19-20]通过大量实验在对表达HER2的乳腺癌细胞研究时发现，当单一受体靶向治疗药物不足以诱导细胞凋亡时，联合双受体抑制可以显示明显效果。即使在被抑制的其中之一受体并没有过表达的情况下，这种诱导凋亡的作用同样存在。原因可能是一种受体抑制剂只能抑制特异的下游信号通路，但该通路仍可能会被另外一个存在交叉信号的通路激活，而2个受体同时抑制能够对下游信号进行更优化阻断[21]。基于此结论，即使单一药物赫赛汀治疗出现耐药的情况下，联合应用另一种抑制IGF1R激活的药物，仍可能对抗肿瘤起到良好效果。DMY可以起到抑制IGF1R激活的作用，对赫赛汀耐药的SKBR3-R细胞经DMY处理后，细胞恢复对赫赛汀的敏感性，细胞的侵袭和增殖程度显著降低，凋亡增加。

综上所述，DMY作为一种纯天然植物提取的化合物，对因IGF1R过度激活导致赫赛汀耐药的SKBR3细胞，可以通过抑制IGF1R下游PI3K/PKB信号通路的激活，恢复肿瘤细胞对赫赛汀的敏感性，并具有协同抗肿瘤作用。而细胞内信号传导网络存在非常复杂的相互联系，导致赫赛汀耐药性的产生还有很多途径[22]，DMY是否还具有其他未知晓的机制，还有待进一步深入的研究。

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Dihydromyricetin enhances herceptin sensitivity to breast cancer cells through inhibiting the insulin-like growth factor 1 receptor downstream phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway

ZHANG Mingliang，PAN Chengwu，WANG Gang，JIN Gongsheng，QIAN Jun
(Department of Oncology Surgery，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030，China)

ObjectiveTo observe the influence of herceptin sensitivity after the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B(PI3K/PKB)signaling pathway activated in SKBR3 cells，and investigate the cooperative mechanism of dihydromyricetin(DMY)enhancing the sensitivity of herceptin to SKBR3 cells.MethodsPI3K/PKB signal pathway was activated by the high dose of insulin-like growth factor 1(IGF1)effected on IGF1 receptor(IGF1R)in SKBR3 cells.SKBR3 cells were treated with DMY，herceptin，DMY combined with herceptin respectively after cultured by high dose of IGF1，western blot was used to detect the expression of IGF1R，human epidermal growth factor receptor 2(HER2)and downstream signaling proteins insulin receptor substrates 1(IRS1)，PKB，phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten(PTEN)and the phosphorylation level of the molecules；3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)assay，transwell migration experiment and flow cytometry were used to observe the proliferation，migration and apoptosis of tumor cells.ResultsThe IRS1 protein phosphorylation level increased significantly(P＜0.01)，PKB protein phosphorylation level rose slowly and then becamestable gradually，and the expression level of PTEN decreased significantly in tumor cells after they cultured by high dose of IGF1(P＜0.01)；DMY could significantly decrease the levels of IRS1(P＜0.01)，PKB protein phosphorylation(P＜0.01)，and increase the expression level of PTEN(P＜0.01)；DMY combined with herceptin treatment could significantly reduce the cells migration ability(P＜0.01)，improve the cells apoptosis rate(P＜0.01).ConclusionIGF1R downstream PI3K/PKB signaling pathway abnormal activation leads to herceptin resistant to SKBR3 cells，DMY could recover the sensibility of herceptin by inhibiting PI3K/PKB signal pathway.

Dihydromyricetin(DMY)；Herceptin；Human epidermal growth factor receptor 2(HER2)；Insulin-like growth factor 1 receptor(IGF1R)；Signal pathway

R392.114；R73－332

A

2095-3097(2017)06-0340-06

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.06.006

安徽省教育厅一般项目(KJ2015B093by)

233030安徽蚌埠，蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科(张明亮，潘成武，王 岗，金功圣，钱 军)

2017-06-18 本文编辑:徐海琴)