针头喷雾常压离子化质谱技术对化生物质的现场检测研究

，* ，*

(1 防化研究院，北京 102205；2 北京理工大学，北京 100081)

针头喷雾常压离子化质谱技术对化生物质的现场检测研究

司昕宇1胡丽丽2张众垚1李翠萍1，*徐伟2，*

(1 防化研究院，北京 102205；2 北京理工大学，北京 100081)

近年来常压离子化技术在对特定物质的快速现场质谱检测提供了一条很好的技术途径。本文针对该技术领域，提出了一种新型的针头喷雾常压离子化方法，在离子阱质谱仪上采用化学毒剂模拟剂(DMMP)样品及其与污水的混合液体、Met-Arg-Phe-Ala(MRFA)肽段生物样品进行了喷雾实验，验证了这种新的喷雾方法对复杂样品的直接质谱检测分析性能。实验结果表明，针头喷雾离子化质谱技术能够对MRFA肽段生物样品进行检测，最低检测限为5 ng/mL；对DMMP液体样品进行在线直接检测，最低检测限为1 ng/mL，检测时间为1.5 min。通过与Nano-ESI喷雾离子化方法对比实验，实验结果表明，采用本文方法检测得到的离子流强度是Nano-ESI方法的2倍，同时离子流信号也较稳定，是一种适合战场化生在线快速检测的新型离子化质谱检测技术。

常压离子源 针头喷雾 MRFA肽段 DMMP

1 前言

质谱仪具有检测种类广谱、灵敏度高、动态范围宽、定性准确等诸多优势。针对化生毒剂检测，质谱技术的广谱性表现为对不同形态(气体、液体、固体)的已知或未知物质，可覆盖从小分子化学物质(含非蛋白毒素)到大分子生物毒剂(含蛋白毒素、细菌及其他微生物)的一体化检测，因此，在当前化生恐怖日益严重的大背景之下，质谱仪作为应对化生武器袭击、化生恐怖威胁、化生事故救援的有效检测工具，在防范化生威胁中扮演了重要的角色。

离子源技术是质谱仪中的关键一环，电子轰击离子源、化学电离离子源等早期离子源，实现了小分子化合物的质谱检测，但这些离子源需要工作在真空条件下，且应用领域有限。常压离子化(Ambient Ionization)技术是指在大气压及样品原始环境下产生离子的技术，不需要或仅仅简单地对样品进行提前处理，同时可对样品进行在线直接电离，告别了高电压、高真空等苛刻的条件，只需质量分析器和检测器处在真空中即可。因此常压离子化技术很好的克服了上述传统离子化技术前端进样系统的缺点，无需放置到真空腔中，为实现现场在线和原位快速检测提供了前端条件的保障，是一种非常适合战场侦测的离子化技术。

近年来，各种新型常压离子源技术迅猛发展，出现了多种的新型离子源，从解析电喷雾电离(Desorption Electro spray Ionization，DESI)[1,2]、直接实时分析电离(Direct Analysis in Real Time, DART)[3,4]到纸喷雾电离(Paper Spray, PS)[5,6]、叶片喷雾电离(Leaf Spray)[7]、牙签喷雾电离(Toothpick spray)[8]、纳升电喷雾电离(Nano-ESI)[9]等。这些常压离子源不断出现，其目的都是为了提供一种更加快速简单的、可以减少对样品的预处理的过程电喷雾方式，达到实现现场快速质谱检测的目的。

本文针对这种需要提出了一种新的针头喷雾常压离子化方法，采用一次性的医用注射器与孔径分离膜相结合作为喷雾离子源，与HCT离子阱质谱仪结合进行了离子化条件的研究，并开展了对MRFA肽段为代表的生物大分子的检测以及DMMP为代表的化学毒剂模拟剂液体及其与污水混合样品的直接在线质谱检测。

2 样品与仪器

2.1 样品来源

Met-Arg-Phe-Ala(MRFA)肽段、甲醇、采购于美国Sigma-Aldrich公司；实验用纯净水购于浙江娃哈哈公司；甲基磷酸二甲酯(dimethyl methylphosphonate, DMMP)采购于北京化学药剂有限公司；污水由实验拖布污水桶中获得。

2.2 样品配置

取MRFA固体1 mg作为溶质，1 mL体积比为1∶1的甲醇水溶液作为溶剂，配置浓度为1000 μg/mL的MRFA甲醇水溶液母液，稀释母液至不同浓度。

取1 mg DMMP液体作为溶质，用甲醇溶液作为溶剂，将溶质定容至1mL，得到浓度1000 μg/mL的甲基磷酸二甲酯溶液，再用体积比为1∶1的甲醇和污水的混合溶液(污水来自实验室污水桶)稀释母液至不同浓度。

2.3 实验仪器

所有的实验质谱结果都来自于Bruker HCT 离子阱质谱仪，氮气用作干燥气体，使用正离子模式。微流注射泵采用model KDS-100，一次性医用注射器(内径0.25mm)购于江苏治宇医用设备公司，孔径膜购于天津津腾实验仪器公司。Nano喷雾管由Nano-ESI所用玻璃毛细管的尖端直径为5 μm，内径为0.8 mm，外径为1.5 mm，通过Sutter Instrument公司型号为P-1000拉管仪获得。

3 实验方法、结果及讨论

针头喷雾离子源就是采用医疗用一次性医用注射器，在针头处装填内径为0.2 mm的纯铜漆包线后，再对针头施加直流高压，这样常规的医用针头就可以作为样品的采集和喷雾离子源，其操作流程如图1所示。对污水样品无需进行萃取等预处理工作，使用医用针头提取样品后，便可直接进行样品的喷雾检测，提取样品时间大约需要20 s；对针头喷雾离子化方法外加电压，将医用针头安装在微流注射泵、设置参数等大约需要40 s；对计算机操作，得到质谱结果大约需要30 s。从提取样品到得到结果总共需要的时间大约为1.5 min，体现了针头喷雾离子化方法在快速质谱检测中的速度优势。

图1 针头喷雾的流程图

在实验中采用如下的针头喷雾离子化参数：针头的外加电压设置为3.4 kV、针头与质谱仪入口的夹角为30度、微流注射泵的推速为10 μL/h。

为了验证该喷雾方法可以对生物大分子进行检测，实验中选取MRFA作为待测样品。MRFA是一种无色粉末状物质，其分子式为 C23H37N7O5S，相对分子质量为523.6 Da。记录对不同浓度的MRFA溶液进行针头质谱检测的总特征离子流强度，如表1所示，得到的线性回归曲线如图2所示，测试得到的最低检测限LOD为5ng/mL、线性度R2= 0.9878。最低检测限的质谱图如图3所示，对m/z=524的特征峰进行二次碎裂，得到图3中的m/z=506是样品分子去掉一个羟基的碎片峰，m/z=271是样品分子去掉苯丙氨酸与丙氨酸分子基团得到的碎片峰。

表1 MRFA的在不同浓度下质谱检测的总特征离子流强度

图2 MRFA肽段检测的线性回归曲线

图3 5 ng/ml的MRFA肽段检测的质谱图

为了验证针头喷雾的离子化效果，将针头喷雾离子化方法与Nano-ESI离子化方法进行对比。图4是对浓度为1 μg/mL的MRFA样品总离子流强度随分析时间变化的记录图。其中上方曲线是针头喷雾的离子流强度，下方曲线为Nano-ESI的离子流强度(Nano-ESI外加电压为0.7 kV)。在10分钟内，针头喷雾离子化方法与Nano-ESI离子化方法相比对于同样浓度的MRFA样品，得到的信号强度约为Nano-ESI的2倍，表现为离子流信号强度更高，离子流信号也比较稳定。同时证明针头喷雾可以长时间提供稳定的喷雾。

图4 针头喷雾与Nano-ESI的检测性能对照结果

为了验证这种喷雾离子化方法对于复杂样品可以直接进行质谱分析，而不需要萃取、过滤等预处理过程，实验中对化学毒剂模拟剂与污水混合样品进行了针头喷雾离子化质谱分析。甲基磷酸二甲酯(dimethyl methylphosphonate, DMMP)是神经性化学毒剂GB的模拟剂，其分子式为C3H9O3P，相对分子质量为124.08 Da，是一种低黏度无色或浅黄色透明液体，挥发性较好。对DMMP的液体和污水(由实验拖布污水桶中取样)混合样品进行针头喷雾质谱检测，获得记录采用针头喷雾质谱检测方法对不同浓度的甲基磷酸二甲酯污水溶液的离子流强度，如表2所示，得到的线性回归曲线如图5所示，得到的最低检测限(LOD)为1ng/mL，最低检测限的质谱图如图6所示，其中，m/z=125是样品分子结合H+后的特征峰，m/z=109是样品分子掉一个甲基后形成的碎片峰，m/z=94是再去掉一个甲基得到的碎片峰。

表2 DMMP污水溶液在不同浓度下质谱检测得到的总特征离子流强度

图5 DMMP污水溶液检测的线性回归曲线

图6 1ng/ml的DMMP污水溶液检测的质谱图

污水中含有细菌、灰尘等干扰物质，在质谱检测中进入质谱仪会对质谱检测结果造成干扰，同时也会对仪器造成污染等。但当这些大颗粒物质样品在微流注射泵的推动作用下流过微滤膜时，微滤膜会截留这些干扰物质，起到过滤的效果。图7为同样的DMMP污水溶液在经过微滤膜前后在电子倒置显微镜下的图片对比结果，从图7中可以清楚的看到一些大颗粒物质已经被被微滤膜过滤。同时微滤膜由均匀的连续体构成，过滤时没有介质的脱落，不会造成对质谱检测结果产生二次干扰的影响，图6的质谱检测结果几乎没有干扰峰也可以说明这一结果。

图7 微滤膜对污水液体样品进行过滤前后的对比图

4 结 论

医用针头作为一种廉价、易获取的常见医疗器械，获取十分方便，同时不锈钢针头坚固耐用，可以应对在复杂环境下液体的样品提取工作，本文采用一次性医用针头作为样品的采集、运输载体，同时承担常压离子源的角色，对MRFA溶液进行针头喷雾检测，得到的最低检测限为5 ng/mL；将其与常用的Nano-ESI技术进行对比，实验结果表明其离子化效率约为Nano-ESI离子化方法的2倍；同时针对DMMP的污水样品进行了针头喷雾离子化质谱检测，得到DMMP污水样品的最低检测限达到了1 ng/mL。

一次性的医用针头与微滤膜总价在2元左右，价格低廉，同时一次性使用也避免了反复操作带来的对检测结果的干扰。从样品采样到得到质谱检测结果大约只需要1.5分钟左右，操作时间短。最重要的是，针头喷雾可以直接进行取样分析，不需要对复杂样品进行提纯等预处理工作。因此，在未来战场上进行化生检测时，对士兵进行简单培训后即可完成操作。可见，这种新型的常压离子化质谱检测方法对于在战场条件或化生毒剂袭击现场实现对化生毒剂和有毒物质的在线快速检测具有重要的意义，在未来的生化物质的快速检测中展现了较好的发展前景。

[1]Takats. Z, Wiseman J M, Gologan B, Cooks R G. Science, 2004, 306(5695): 471-473.

[2]Keil A, Talaty N, Janfelt C, et al. Ambient mass spectrometry with a handheld mass spectrometer at high pressure[J]. Analytical chemistry, 2007, 79(20): 7734-7739.

[3]Cody R B, Laramée J A, Durst H D. Versatile new ion source for the analysis of materials in open air under ambient conditions[J]. Analytical chemistry, 2005, 77(8): 2297-2302.

[4]Chen H, Talaty N N, Takáts Z, et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry for high-throughput analysis of pharmaceutical samples in the ambient environment[J]. Analytical chemistry, 2005, 77(21): 6915-6927.

[5]Liu J, Wang H, Manicke N E, et al. Development, characterization, and application of paper spray ionization[J]. Analytical chemistry, 2010, 82(6): 2463-2471.

[6]Wang H, Liu J, Cooks R G, et al. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry[J]. Angewandte Chemie, 2010, 122(5): 889-892.

[7]Liu J, Wang H, Cooks R G, et al. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry[J]. Analytical chemistry, 2011, 83(20): 7608-7613.

[8]Hu B, So P-K, Chen H, et al. Electrospray ionization using wooden tips[J]. Analytical chemistry, 2011, 83(21): 8201-8207.

[9] Wilm M, Mann M. Analytical properties of the nanoelectrospray ion source[J]. Analytical chemistry, 1996, 68(1): 1-8.

Studyonfielddetectionofchemicalandbiologicalsubstancebyambientneedlesprayionizationmassspectrometry.

SiXinyu1,HuLili2,ZhangZhongyao1,LiCuiping1,XuWei2*

(1.InstituteofChemicalDefense,Beijing102205,China; 2.BeijingInstituteofTechnology,Beijing100081,China)

Nowadays, ambient ionization provides a technological approach to fast-field mass spectrometry detection of specific substance. Focusing on this field, we presented a new ambient ionization method called needle spray. Spray test with an ion trap mass spectrometer was carried on using chemical agent simulant-DMMP and sewage mixed solution as well as biological sample-MRFA to test the performance of direct mass spectrometry analysis for complexed samples by this new spray method. The results showed that needle spray could solve the problem of mass spectrometry determination of MRFA, and the LOD of MRFA reached 5ng/ml. Meanwhile, the LOD was 1 ng /ml for DMMP liquid sample, and it took 1.5 min for a test. Compared with the Nano-ESI contrast experiment, the TIC of needle spray was doubled and the ion intensity was more stable. Needle spray ionization mass spectrometry is a new mass spectrometry technique which is fit for fast-field chemical and biological detection in battlefield.

ambient ionization；needle spray； MRFA； DMMP

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.05.023

2017-05-26

司昕宇，男，1991年出生，防化研究院在读研究生，Email:417842042@qq.com。

李翠萍，E-mail:cuipingli86@126.com；徐伟，E-mail:weixu@bit.edu.cn。