襄阳大头菜腌制液生物膜真菌多样性研究

赵慧君，沈馨，董蕴，吴竞，凌霞，胡事成，郭壮*

(1.湖北文理学院 化学工程与食品科学学院 鄂西北传统发酵食品研究所，湖北 襄阳 441053； 2.襄阳市食品药品检验所，湖北 襄阳 441021；3.襄阳孔明菜有限公司，湖北 襄阳 441000)

襄阳大头菜腌制液生物膜真菌多样性研究

赵慧君1，沈馨1，董蕴1，吴竞2，凌霞2，胡事成3，郭壮1*

(1.湖北文理学院 化学工程与食品科学学院 鄂西北传统发酵食品研究所，湖北 襄阳 441053； 2.襄阳市食品药品检验所，湖北 襄阳 441021；3.襄阳孔明菜有限公司，湖北 襄阳 441000)

采集了3 个襄阳大头菜腌制液生物膜样品，使用Miseq高通量测序技术对其真菌微生物群落结构进行了解析。在门水平上，Ascomycota平均含量高达99.99%，相对含量大于1%的真菌属分别为Zygosaccharomyces，Pichia和Candida，其平均相对含量分别为56.10%，40.96%和2.32%。在分类操作单元(operational taxonomic units，OTU)水平上，发现24 个核心OTUs，其中OTU62(Zygosaccharomyces)和OTU37(Phialosimplex)的累计平均相对含量为83.60%。由此可见，襄阳大头菜生物膜中的真菌微生物主要由隶属于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia构成，生物膜共有大量的核心真菌菌群。

襄阳大头菜；生物膜；真菌；多样性；Miseq

作为我国四大名腌菜之一的襄阳大头菜是以芥菜为原料，采用独特的“三腌、五卤、六晒”工艺历时18个月腌制而成，该制作工艺至今已有近2000年的历史。因具有口感脆嫩、香味浓郁和历史悠久的特点，2007年襄阳大头菜被列为中国国家地理标志产品，2009年又被列为湖北省非物质文化遗产[1]。襄阳大头菜的腌制主要在腌制池或缸中进行，长达18个月的腌制过程实质上是微生物发酵、食盐高渗透压和蛋白质分解等一系列生化反应协同作用的结果，该过程赋予了大头菜独特的风味和口感[2]。然而襄阳大头菜的生产总体处于粗放式加工状态，由于雨水和尘土等因素的影响，腌制池或缸表面会形成一层白色的生物膜。随着生物膜的出现，大头菜的脆度明显降低且产生刺激性气味，最终导致产品品质下降直至失去经济价值。虽然将生物膜捞出后大量添加食盐可以暂时延缓这一现象的再次发生，但生物膜一经形成就很难控制和去除[3]。

16S rRNA和18S rRNA基因测序技术作为系统遗传学和微生物生态学的“黄金标准”方法[4]，长期应用于环境样品微生物群体的物种组成和丰度研究中。以Miseq为代表的高通量测序技术采用宏基因组学的研究策略，通过将环境样品中微生物的基因组混合作为一个整体进行研究，不仅揭示了微生物群体的物种组成及丰度信息，亦可以解析物种的生物功能，打破了传统微生物学基于纯培养研究的局限性[5]。

本项目以表面长生物膜大头菜腌制液为研究对象，从宏基因组层面，以真菌18S rRNA基因全长为Miseq测序靶点，在各系统分类学地位上对生物膜的真菌群落结构进行了揭示，以期为后续因产生生物膜而导致襄阳大头菜品质下降这一产业化问题的解决提供数据支持和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit：购于德国QIAGEN公司；dNTPs Mix，5×TransStartTM，FastPfu Buffer和FastPfu Fly DNA Polymerase：购于北京全式金生物技术有限公司；DNA 1000 试剂盒：购于美国Agilent公司。

1.2 仪器与设备

5810R台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；UVPCDS8000凝胶成像分析系统 美国BIO-RAD公司；ND-2000C微量紫外分光光度计 美国Nano Drop公司；vetiri梯度基因扩增仪 美国AB公司；DYY-12电泳仪 北京六一仪器厂；2100芯片生物分析仪 美国Agilent公司；Miseq高通量测序平台 美国Illumina公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的采集

从湖北省襄阳孔明菜有限公司的腌制缸中采集长生物膜的大头菜腌制液样品3份。样品采集时，首先使用组织捣碎机将生物膜与腌制液搅拌均匀，然后立即置于4 ℃采样箱内，运送回实验室后置于-80 ℃冷冻储存，48 h内完成DNA的提取。

1.3.2 DNA提取

大头菜腌制液3000 g 离心10 min后收集菌体，采用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit试剂盒提取微生物宏基因组DNA，继而使用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对DNA的浓度和纯度进行测定，符合后续试验要求的DNA保存在-20 ℃备用。

1.3.3 真菌18S rRNA扩增

PCR扩增体系为：5×PCR缓冲液4 μL，2.5 m MdNTPs mix 2 μL，5 μmol/L正向引物0.8 μL，5 μmol/L反向引物0.8 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，体系用ddH2O补充至20 μL。其中真菌18S rRNA正向引物为SSU0817F(5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3')，其反向引物为SSU1196R(5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3')，且在正向引物中加入7个核苷酸标签(barcode)。

扩增条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 10 min，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验合格后，置-20 ℃冰箱备用。

1.3.4 样品平衡及Miseq高通量测序

使用2100芯片生物分析仪将每个样品的DNA模板稀释至100 nmol/L，混合均匀后寄往上海美吉生物医药科技有限公司使用Miseq平台进行高通量测序。

1.3.5 序列的拼接及质控

按照以下流程进行序列的拼接：根据成对序列之间的重叠关系，将双端序列数据拼接成一条序列；根据barcode将所有序列划分到各个样品并对序列方向进行校正；切掉序列barcode和引物。

若在序列拼接过程中存在以下情况则将该序列予以剔除：重叠区的碱基数小于10 bp；重叠区的最大错配比率大于0.2；barcode碱基错配；引物碱基错配数大于2 bp；切掉barcode和引物后若序列碱基数小于50 bp亦予以剔除。

1.3.6 生物信息学分析

使用QIIME(v1.7.0)分析平台[6]对过控合格的序列按照以下流程进行物种分析：

采用PyNAST[7]软件将序列对齐；

以100%的相似度用UCLUST软件[8]划分序列得到无重复单一序列集，建立分类操作单元(operational taxonomic units，OTU)；

以97%相似性使用UCLUST软件进一步划分OTU；

从每条OTU选取1 条代表性序列，使用SILVA[9,10]数据库进行比对，获得门、纲、目、科、属和OTU水平上各真菌的分类信息；

使用 FastTree 软件[11]绘制基于 OTU 代表序列的系统发育进化树，计算香农指数 (Shannon index)、Observed Species(发现物种数)和超 1 指数 (Chao1 index)，进而对襄阳大头菜腌制液生物膜alpha多样性进行计算。

1.3.7 核酸登录号

本研究中所有Miseq序列数据已提交至MG-RAST数据库，ID号为mgp79759。

2 结果与分析

2.1 序列丰富度和多样性分析

纳入本研究的3 个腌制液生物膜样品18S rRNA测序情况及各分类地位数量见表1。

表1 样品18S rRNA测序情况及各分类地位数量Table 1 Sample 18S rRNA sequencing and the number of taxonomic status

注：计算每个样品Chao1和Shannon指数时，样品的测序量均为30010条序列。

由表1可知，通过Miseq高通量测序，本研究采集的3 个样品共产生了101882 条高质量16S rRNA序列，平均每个样品产生33961 条。经过100%序列鉴定聚类分析后，本研究共得到16833 条代表性序列，根据序列的97%相似性进行操作分类单元划分后，共得到93 个OTU，每个样品平均51 个OTU。进一步使用稀疏曲线和香农指数曲线对本研究产生的数据量是否满足后续生物信息学分析进行了评价，其结果见图1。

图1 稀疏曲线图(A)和香农指数曲线图(B)Fig.1 Sparse curve (A) and Shannon index curve (B)

由图1可知，随着测序量的增加，稀疏曲线未进入平台期(A)而香农指数曲线进入了平台期(B)，这说明随着测序量的增加，新的种系型可能会被发现，但微生物的群落结构不会再发生改变了，由此可见，本研究产生的序列数是可以满足后续生物信息学分析要求的。

2.2 基于不同分类地位核心菌群相对含量的分析

本研究使用SILVA数据库对OTU代表性序列进行了同源性比对，所有的序列鉴定为2 个门、6 个纲、7 个目、8 个科和12 个属，仅有0.006%的序列不能鉴定到属水平。其中MBZ1和MBZ2样品中仅发现Ascomycota这1 个真菌门，在MBZ3样品中除Ascomycota外，亦发现了Basidiomycota，但其相对含量仅为0.0063%。由此可见，襄阳大头菜生物膜中的真菌微生物主要隶属于Ascomycota。如果某一真菌属在3 个样品中的平均相对含量大于1.0%，则将其定义为优势真菌属。不同样品中优势真菌属相对含量的比较分析见图2。

图2 襄阳大头菜腌制液生物膜中优势真菌属相对含量的比较分析Fig.2 Comparative analysis of the relative content of dominant fungi in the biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由图2可知，纳入本研究的3个腌制液生物膜样品中优势真菌属分别为Zygosaccharomyces，Pichia和Candida，其相对含量分别为56.10%，40.96%和2.32%，其他9个属的相对含量累计为0.62%。由此可见，襄阳大头菜生物膜中的真菌微生物主要由隶属于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia构成。徐婷等使用YPD培养基，采用纯培养的方法从长有生物膜的襄阳大头菜卤水中分离了1株酵母菌，并将其鉴定为Zygosaccharomycesrouxii。值得一提的是，经文献调研发现，在泡菜[12]和葡萄酒[13]等发酵食品的制作过程中亦有生物膜现象的出现，类似的问题同样影响了上述食品行业的发展。饶瑜等[14]对泡菜生物膜中真菌进行了分离，研究表明Pichiakluyveri可以导致生物膜的形成。由此可见，Zygosaccharomyces下的真菌种可能具有致生物膜产生的作用。

如果某一个真菌属在3个样品中均存在，则本研究将其定义为核心菌属，襄阳大头菜腌制液生物膜中核心真菌属的构成及含量见图3。

图3 襄阳大头菜腌制液生物膜中核心真菌属的构成及含量分析Fig.3 Analysis of the composition and content of core fungi in the biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由图3可知，Zygosaccharomyces，Pichia和Candida既为优势属又为核心属，除此之外，Phialosimplex亦为核心属，其相对含量为0.60%。本研究进一步统计了OTU在3个样品中出现的次数，其结果见图4。

图4 OTU在襄阳大头菜腌制液生物膜样品中出现次数统计Fig.4 The number of times of occurrence of OTU in the samples of biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由图4可知，3个襄阳大头菜腌制液生物膜样品共产生93个OTU，然而在3个样品中仅出现1 次的OTU为56个，占OTU总数的60.22%，所包含序列数为530条，占所有质控后合格序列数的0.52%。本研究每个样品平均产生33960条序列，而每个样品中仅出现1次的OTU平均每个含有9.5条序列，则每个仅出现1次的OTU其包含序列的平均相对含量仅为0.028%。基于OTU水平的Venn图见图5。

图5 基于OTU水平的Venn图Fig.5 Venn diagram based on OTU level

由图5可知，MBZ1和MBZ2共有5个OTUs和21条序列，MBZ1和MBZ3共有4 个OTUs和60 条序列，MBZ2和MBZ3共有4 个OTUs和218条序列。虽然纳入本研究的3个襄阳大头菜生物膜样品中共发现24个真菌的核心OTUs，占OTU总数的25.81%，但其包含101053条序列，占所有质控后合格序列数的99.19%。由此可见，虽然有的襄阳大头菜腌制液生物膜样品中可能含有一些较为独特的种系型，但其相对含量是极低的，因而样品共有大量的核心真菌菌群，核心OTU在3个襄阳大头菜生物膜样品中相对含量的热图见图6。

图6 核心OTU在各襄阳大头菜腌制液生物膜样品中相对含量的热图Fig.6 Heat map of the relative content of core OTU in biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

注：依据OTU的进化关系建立了左侧的系统发育树。

由图6可知，24个OTUs中，15个隶属于Zygosaccharomyces，各有3 个隶属于Pichia，Phialosimplex和Candida。值得一提的是，OTU62(Zygosaccharomyces)在3个样品中的相对含量高达54.02%，51.23%和24.14%，而OTU37(Phialosimplex)相对含量高达33.07%，24.59%和63.74%，2个OTU的累计相对含量分别为87.09%，75.82%和87.88%，这也进一步证实了虽然襄阳大头菜腌制液生物膜样品共有大量的核心真菌菌群，但核心真菌菌群的多样性相对较低，2个OTUs的相对含量就占到了真菌类群的80%左右。本研究进一步对核心属和核心OTU之间的相关性进行了分析，其结果见图7。

图7 核心属和平均相对含量大于1.0%的核心OTU相关性的热图Fig.7 Heat map of correlation among the core fungi genera (A) and OTU with relative content more than 1.0% (B)

注：依据相关系数建立左侧和顶端聚类树。

由图7可知，4个核心真菌属之间相关性均不显著(P>0.05)，除OTU62(Zygosaccharomyces)和OTU37(Phialosimplex)外，OTU86(Candida)的平均相对含量也大于1.0%，然而3 个OTU之间亦均无相关性(P>0.05)。

3 结论

襄阳大头菜生物膜中的真菌微生物主要由隶属于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia构成，虽然有的样品中可能含有一些较为独特的种系型，但生物膜样品共有大量的核心真菌菌群。

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StudyontheDiversityofFungalMicrofloraofBiomembraneinXiangyangMustardRootBrine

ZHAO Hui-jun1, SHEN Xin1, DONG Yun1, WU Jing2, LING Xia2, HU Shi-cheng3, GUO Zhuang1*

(1.Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food, College of Chemical Engineering and Food Science, Hubei University of Arts and Science, Xiangyang 441053, China; 2.Xiangyang Institute of Food and Drug Supervision, Xiangyang 441021, China; 3.Xiangyang Kongmingcai Co.,Ltd ., Xiangyang 441000, China)

In the current study, 3 biomembrane samples of Xiangyang mustard root brine are collected, and the fungal microbiota are studied by Miseq high throughput sequencing technologies.Ascomycotais the most dominant fungal phylum with the relative abundance of 99.99%. At the phylum level,Zygosaccharomyces,PichiaandCandidaare constituting more than 1% of total sequences, with the relative abundance of 56.10%, 40.96% and 2.32% respectively. At the OTU level,24 OTUs are shared by all samples, and the cumulative average relative content of OTU62(Zygosaccharomyces)and OTU37(Phialosimplex)is 83.60%. The results indicate that the fungal microbiota of biomembrane in Xiangyang mustard root brine are main consisted byZygosaccharomycesandPichiabelong toAscomycota, and biomembrane samples have a large number of core fungal flora.

Xiangyang mustard root；biomembrane；fungus；diversity；Miseq

TS255.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.013

1000-9973(2017)12-0061-05

2017-07-15 *通讯作者

湖北省食品药品监督管理局科研项目(201601025)；襄阳市科技计划研究与开发项目(2016)；湖北文理学院食品新型工业化学科群建设项目(2017)

赵慧君(1979-)，女，讲师，博士，研究方向：食品生物技术；

郭壮(1984-)，男，副教授，博士，研究方向：食品生物技术。