家鸡G蛋白偶联受体161的基因克隆、分子进化和组织表达

祝国强， 莫春横， 李正阳， 王亚军， 李娟

(四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065)

家鸡G蛋白偶联受体161的基因克隆、分子进化和组织表达

祝国强， 莫春横， 李正阳， 王亚军， 李娟*

(四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065)

G蛋白偶联受体161(GPR161)是G蛋白偶联受体家族孤儿受体家族成员，在哺乳动物晶状体发育调节和神经胚形成中具有重要作用。近年来研究发现该蛋白罕见地拥有类似支架蛋白的结构特征，暗示其信号转导机制不同于其他G蛋白偶联受体。本研究以家鸡Gallusgallus为动物模型，探究GPR161基因序列信息、分子遗传进化关系以及其组织表达图谱。家鸡GPR161基因编码区序列全长1 566 bp，编码具521个氨基酸的前体蛋白。序列分析显示，家鸡GPR161基因编码区与人Homosapiens、小鼠Musmusculus、斑马鱼Daniorerio的氨基酸相似度分别为83.0%、82.6%、65.8%。分子进化遗传分析结果显示，GPR161基因在家鸡与斑马鱼的进化关系比家鸡与人或小鼠都更为疏远。利用荧光定量PCR探究家鸡GPR161基因在各组织的表达分布，结果显示，家鸡GPR161基因mRNA在精巢或卵巢、大脑、心脏、肌肉中有较高表达。本研究是鸟类中关于GPR161基因的首次报道，研究结果为进一步探究GPR161基因在鸟类中的生理效应提供参考。

家鸡；GPR161； 基因克隆； 分子进化； 组织表达

G蛋白偶联受体是细胞表面受体中最大并最具多样性的家族，其家族成员均具典型7次跨膜结构，介导视觉、嗅觉、行为等众多生理活动(Morris & Malbon，1999)。在人中已发现并获得鉴定的G蛋白偶联受体超过1 000种，约占人类基因总数的5%(Consortium，2004；Zhangetal.，2006)，截至目前，该数量仍在缓慢增加，凸显G蛋白偶联受体在细胞功能实现中的重要作用。

G蛋白偶联受体161(G protein-coupled receptor 161，GPR161)属于G蛋白偶联受体家族孤儿受体家族成员，这一类受体家族成员的内源性配体有待鉴定(Gainetdinovetal.，2004)。尽管缺乏其内源性配体信息，但GPR161被报道在调节晶状体发育和神经胚形成中具有重要作用。空泡化晶状体症小鼠突变体带有先天白内障和神经管畸形，研究发现该表型源于GPR161基因8 bp碱基缺失(Mattesonetal.，2008)。原位杂交实验结果进一步显示，GPR161基因的表达伴随着晶状体发育的完整阶段，侧面印证GPR161功能缺失可能是白内障的成因(Mattesonetal.，2008)。进一步的研究发现，GPR161的生理功能不仅涉及空泡化晶状体症，还参与调控左右心室形成、乳腺癌细胞的增殖以及垂体柄阻断综合症的发生(Leungetal.，2008；Feiginetal.，2014；Karacaetal.，2014)。

在传统的G蛋白偶联受体信号通路中，胞外配体结合受体激活G蛋白，激活的亚基包括G蛋白α亚基以及β和γ亚基进一步激活下游效应器，包括各种激酶等，促进通路持续(Morris & Malbon，1999)。在信号转导进程中，支架蛋白成为重要的连接器。各种GTP酶、激酶、磷酸化酶等信号蛋白在支架蛋白介导下获得次序激活，掌控多样生理效应。以支架蛋白A类激酶锚定蛋白为例，不同的A类激酶锚定蛋白锚定Ⅰ型或Ⅱ型蛋白激酶A，释放二级信号分子，最终激活环磷酸腺苷感受信号通路(Wong & Scott，2004；Langeberg & Scott，2015)。此外，支架蛋白与G蛋白偶联受体具有物理连接，对G蛋白偶联受体的定位和活性调节有重要意义(Ritter & Hall，2009)。研究表明，GPR161基因除了具G蛋白偶联受体经典的结构特征，其C末端还罕见地包含作为支架蛋白A类激酶锚定蛋白共有的两性分子螺旋，提示该蛋白可以直接锚定、富集Ⅰ型蛋白激酶A，在信号转导进程中发挥更为重要的主导作用，其结构意义及潜在的效应机制备受关注(Mukhopadhyayetal.，2013；Bachmannetal.，2016)。

综上，GPR161基因参与介导机体重要生理效应，其结构特征亦值得进一步探究。至今，针对GPR161基因的研究报道仍然相对匮乏，且GPR161基因序列在鸟类中至今仍未获得鉴定。家鸡Gallusgallus是鸟类模式生物，是脊椎动物进化中最为重要的过渡类群。本研究首次报道家鸡GPR161基因的编码区序列，预测其二级结构，同时也检测其在成体家鸡中的组织表达图谱，研究结果为阐释GPR161基因在脊椎动物中的生理效应提供基础信息。

1 材料与方法

1.1材料

本实验所用动物为罗曼粉成年家鸡，购自四川牧星养鸡场；引物合成、DNA测序工作由成都擎科公司完成；组织保存和RNA提取所用的RNAzol购自Molecular Research Central；MMLV逆转录酶、dNTP、KOD-Fx高保真聚合酶、Easy-Taq酶、pTA-2载体、限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)；分子克隆宿主大肠杆菌EscherichiacoliDH5α由本实验室制备保存；荧光定量PCR仪Bio-Rad CFX96、荧光染料Eva Green、96孔板、塑料封膜购自Bio-Rad。

1.2方法

1.2.1总RNA提取取家鸡组织包括脂肪、肾上腺、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、皮肤、脾脏、精巢等，迅速放入液氮中速冻，并用研钵研棒保证组织浸泡在液氮中充分研磨成粉末。后续步骤严格按照RNA extraction kits说明书(TaKaRa)提取总RNA：取约60 μg组织粉末，与600 μL RNAzol混合；补充240 μL DEPC灭菌水，用涡旋仪混匀约15 s；在高速冷冻离心机中，于4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min；取上清，加入3 μL阿司咪唑，涡旋15 s后于4 ℃、12 000 r·min-1冷冻离心10 min；取上清，加入等体积异丙醇，于4 ℃、12 000 r·min-1冷冻离心10 min；小心吸取上清并弃掉，加入75%乙醇漂洗总RNA沉淀，于4 ℃、8 000 r·min-1冷冻离心3 min；重复上一步，漂洗RNA沉淀；弃上清，用20 μL DEPC灭菌水溶解沉淀，及时构建cDNA文库或于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2cDNA模板制备以各组织总RNA为模板进行逆转录构建cDNA文库，具体步骤如下：取2 μg各组织的总RNA样品，与1 μL Oligo-dT混合；补DEPC灭菌水至总体积5 μL (Oligo-dT终浓度为0.5 μg·μL-1)，混匀；于PCR仪中70 ℃加热10 min后，立即取出放置于冰上10 min；加入2 μL 5×RT buffer，0.5 μL MMLV逆转录酶，0.5 μL dNTPs，补充DEPC灭菌水至总体积10 μL，混匀；于PCR仪中42 ℃反应1.5 h，后又70 ℃反应10 min结束；取反应所得产物加入70 μL灭菌水，所得混合溶液即为cDNA模板。

1.2.3载体构建根据Ensemble数据库提供的家鸡基因组信息，遵循引物设计原理并使用DNAMAN 8.0(Lynnon Biosoft)设计家鸡GPR161基因编码区全长引物(上游引物cGPR161-U1和下游引物cGPR161-L1)和组织表达所需的荧光定量引物(上游引物cGPR161-qU1和下游引物cGPR161-qL1)。以家鸡脂肪组织cDNA为模板，使用编码区全长引物对GPR161基因的开放阅读框(ORF)区域进行扩增。PCR扩增体系如下：5 μL 2×KOD缓冲液，2 μL脂肪组织cDNA模板，2 μL dNTPs，上游引物cGPR161-U1和下游引物cGPR161-L1各0.1 μL，0.5 μL KOD-Fx聚合酶，0.3 μL去离子灭菌水。PCR扩增条件如下：94 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，34个循环；72 ℃最后延伸10 min。然后分别取3 μL反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

取4.5 μL PCR产物与0.5 μL 10×A-attachment Mix混合，置于PCR仪中60 ℃反应30 min，保证KOD-Fx聚合酶扩增的平末端产物的3’末端加上碱基A；反应混合液与pTA-2载体进行4 ℃过夜连接；将连接产物转入DH5α感受态细胞，并均匀涂布在加有抗氨苄的LB固体培养皿中进行蓝白斑筛选；利用pTA-2载体通用引物挑选特异性阳性单克隆，送成都擎科公司进行双向测序。

1.2.4生物信息分析对获得的家鸡GPR161氨基酸序列与NCBI数据库中其他物种已知或预测序列，使用DNAMAN 8.0(Lynnon Biosoft)和在线网站ESPript(Easy Sequencing in PostScript)进行氨基酸相似度比对(Robert & Gouet，2014)，分子进化遗传学分析采用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)依托MEGA 6.0完成(Tamuraetal.，2013)，基因功能预测使用在线BioGRID数据库(Biological General Repository for Interaction Datasets)(Chatr-aryamontrietal.，2016)。

1.2.5组织表达采用家鸡不同组织的cDNA模板，以荧光定量PCR方法检测各组织的表达情况。荧光定量PCR的扩增体系如下：2%DMSO，9.5 μL去离子灭菌水，2 μL 10×buffer，6 μL cDNA模板，0.4 μL dNTPs，上游引物cGPR161-qU1和下游引物cGPR161-qL1各0.2 μL，1 μL荧光染料Eva Green，1 μL Easy-Taq酶，总体积为20 μL。荧光定量PCR的扩增条件如下：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，39个循环，然后按照0.5 ℃/5 s的速度从70 ℃到95 ℃向上升温熔解，生成熔解曲线。荧光定量PCR的结果按照比较CT值法(2-ΔΔCT法)进行数据处理(Schmittgen & Livak，2008)，步骤如下：首先将各组织样品结果GPR161的CT值减去对应组织内参基因β-actin的CT值，得到各组织的ΔCT值；然后将GPR161在大脑中的表达量选作参考，并将上一步分别所得的各组织的ΔCT值减去大脑的ΔCT值，得到ΔΔCT值；最后计算2-ΔΔCT值，得到各组织中GPR161相对大脑中GPR161的表达量倍数，即GPR161在各组织间的相对表达量。

2 结果

2.1家鸡GPR161基因的克隆

参照NCBI数据库中预测的家鸡GPR161基因序列和Ensemble数据库中的家鸡全基因组设计上、下游PCR引物(表1)，采用家鸡脂肪组织cDNA为模板，使用高保真酶KOD扩增家鸡GPR161序列。凝胶电泳显示，扩增条带大小与预期一致，略大于1 500 bp(图1)。将该片段与pTA-2载体连接后转化到DH5α中，经蓝白斑筛选得到阳性单克隆。提取质粒，酶切检验确保重组质粒的完整性后，选取3个单克隆质粒送公司测序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

图1 家鸡GPR161基因扩增Fig. 1 PCR amplification of chicken GPR161 gene

2.2家鸡GPR161基因的序列分析

测序结果显示，家鸡GPR161基因编码区ORF长度为1 566 bp，编码521个氨基酸。与家鸡全基因组序列比对后发现，家鸡GPR161基因位于家鸡1号染色体上，编码区没有内含子。将家鸡GPR161基因编码区氨基酸序列与人Homosapiens、小鼠Musmusculus、斑马鱼Daniorerio的进行比对(图2)，发现其与人、小鼠、斑马鱼的相似度分别为83.0%、82.6%、65.8%。家鸡GPR161基因含有G蛋白偶联受体的7次跨膜区经典结构，同时还含有支架蛋白A类激酶锚定蛋白的两性分子螺旋结构(图2)。

图2 家鸡GPR161与斑马鱼、人、小鼠的基因编码区氨基酸序列比对Fig. 2 Alignment of the amino acid sequence of GPR161 gene from chicken， zebrafish， human and mouse

TM1～7示经典跨膜区域， 两性分子螺旋结构在方框中标识。

TM1-7 shows the typical transmembrane domains， the amphipathic helix is indicated.

2.3家鸡GPR161基因的分子进化遗传学分析

尽管GPR161基因序列信息目前只在人、小鼠、斑马鱼和家鸡中得到鉴定，但是随着测序技术的发展和越来越多物种的基因组被破译，不同物种中未经实验数据验证的GPR161基因预测序列或片段也能够从Ensemble数据库获得。为了更加全面地探究GPR161基因在不同物种间的分子遗传学进化，分子系统进化树结果显示，家鸡与火鸡Meleagrisgallopavo的同源性最高，且与爬行类中华鳖Pelodiscussinensis、鸟类斑胸草雀Taeniopygiaguttata分子进化关系也较为接近，人和小鼠次之，与斑马鱼进化关系则相对较远(图3)。

图3 GPR161基因的分子系统进化树Fig. 3 Molecular phylogenetic tree of GPR161 gene

2.4家鸡GPR161基因的功能预测

依托于测序产生的大数据，对某个基因或基因家族的生物信息学进行功能注释，目前已逐渐成为分析和预测基因功能的重要技术。在线BioGRID数据库预测了可能与GPR161基因有蛋白相互作用的基因(图4)。对蛋白互作网络的GO功能注释分析显示，GPR161主要参与G蛋白偶联受体信号通路、腹侧神经管平滑信号通路的负调控、cAMP生物合成的正调控、初级纤毛的生成等生理功能，比如PPKACA、PPKACB、PPKACG是蛋白激酶A的组成亚基，直接介导cAMP信号。

2.5家鸡GPR161基因mRNA组织表达分析

为探究GPR161基因在家鸡各组织中的生理学效应差异，以成体家鸡各组织cDNA为模板，用荧光定量PCR方法检测GPR161基因在家鸡各组织中的mRNA水平表达分布情况。各组织的样本数均大于或等于4。结果显示，GPR161基因mRNA在家鸡的精巢或卵巢、大脑、心脏、肌肉中有较高的表达，但在脂肪、肾脏、肺中表达量相对较低，在肝脏、胰腺、皮肤、脾脏中则检测到更弱的表达信号(图5)。

图4 GPR161基因蛋白-蛋白间互作网络Fig. 4 The network of protein-protein interactions with GPR161 gene

图5 荧光定量PCR检测GPR161基因mRNA在家鸡各组织中的表达Fig. 5 qPCR detection of GPR161 gene mRNA expression in chicken tissues

Br. 大脑， Ad.脂肪， He. 心脏， Ki. 肾脏， Li. 肝脏， Lu. 肺， Mu. 肌肉， Pa. 胰腺， Sk. 皮肤， Sp. 脾脏， Te. 精巢， Ov. 卵巢。

Br. brain， Ad. adipose， He. heart， Ki. kidney， Li. liver， Lu. lung， Mu. muscle， Pa. pancreas， Sk. skin， Sp. spleen， Te. testis， Ov. Ovary.

3 讨论

GPR161基因被报道在晶状体发育、神经胚形成、左右心室形成、乳腺癌细胞增殖、垂体柄阻断综合症的发生等疾病中扮演重要角色(Leungetal.，2008；Mattesonetal.，2008；Feiginetal.，2014；Karacaetal.，2014)。该基因在结构上罕见地拥有支架蛋白A类激酶锚定蛋白类似结构，凸显其独特结构特征并暗示其特别的调控机制。本研究首次报道家鸡GPR161基因的序列信息、分子进化关系以及其组织表达图谱。

家鸡GPR161基因编码区ORF长度为1 566 bp，编码521个氨基酸。序列分析显示，家鸡GPR161氨基酸序列与哺乳动物具有较高的序列相似性(人：83.0%；小鼠：82.6%)，而与斑马鱼的相似度相对较低(斑马鱼：65.8%)。分子进化遗传分析表明，GPR161基因在家鸡与火鸡的同源性最高，且与爬行类中华鳖、鸟类斑胸草雀分子进化关系也较为接近，人和小鼠次之，而与斑马鱼进化关系相对较远。

本研究也对GPR161的生理功能做了初步预测。通过在线BioGRID数据库预测了GPR161参与G蛋白偶联受体信号通路、cAMP生物合成的正调控等生理功能，这与目前在初级纤毛的发育等研究报道一致(Mukhopadhyayetal.，2013；Bachmannetal.，2016；Paletal.，2016)。利用荧光定量PCR分析技术解析获得家鸡GPR161基因组织表达图谱，为探究其在各器官的生理学意义提供了参考依据。家鸡GPR161基因主要在精巢或卵巢、大脑、心脏、肌肉组织中高表达，该研究结果与人、小鼠、斑马鱼的报道基本一致。在人和小鼠的大脑、神经管、垂体等神经系统中，GPR161基因mRNA被检测到高水平表达(Mukhopadhyayetal.，2013；Karacaetal.，2014)。在斑马鱼的胚胎发育中，GPR161基因mRNA的高水平表达信号亦在心脏中被检测到(Leungetal.，2008)。GPR161基因在家鸡大脑与心脏组织中的高表达，暗示该基因在家鸡中很可能介导与哺乳动物和鱼类类似的生理效应，即参与促进神经胚的形成及左右心室的发育等(Leungetal.，2008；Mattesonetal.，2008；Lietal.，2015)。与之相对的是，家鸡GPR161基因在肾脏、脂肪、肺中的表达量相对较低，在肝脏、胰腺、皮肤、脾脏中表达信号更弱。本研究结果为阐释GPR161基因在脊椎动物中的生理效应提供了基础信息。

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GeneCloning，MolecularEvolutionandTissueExpressionofGProtein-coupledReceptor161inChicken

ZHU Guoqiang， MO Chunheng， LI Zhengyang， WANG Yajun， LI Juan*

(Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Education， College of Life Sciences，Sichuan University， Chengdu 610065， China)

G protein-coupled receptor 161 (GPR161) is a member of GPCRs， and this orphan receptor plays an important role in the lens development and neurulation of mammals. Recent study showed that the structure of GPR161 was similar with scaffolding proteins and thus may had a potential function in signal transduction. Using chicken as experimental model， the cDNA sequence， molecular evolution and tissue expression of chickenGPR161 gene were investigated in this study. The full-length coding sequence of chickenGPR161 gene was 1 566 bp in length and encoding 521 amino acids. Sequence analysis revealed thatGPR161 of chicken had high sequence similarity with that of human (83.0%)， mouse (82.6%) or zebrafish (65.8%). Molecular evolutionary genetical analysis showed that the relationship ofGPR161 among chicken， human and mouse were closer than that of chicken and zebrafish. The result of real-time quantitative PCR showed that the mRNA level ofGPR161 gene was abundant in testis or ovary， brain， heart and muscle. Our data provide a basis for the study of the physiological function ofGPR161 gene in birds.

chicken;GPR161; gene cloning; molecular evolution; tissue expression

10.11984/j.issn.1000-7083.20170140

2017-05-02接受日期2017-07-22

祝国强(1992—)， 硕士， 主要从事动物分子遗传研究， E-mail：872139941@qq.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：lijuanscuhk@163.com

Q959.7； Q78

A

1000-7083(2017)06-0632-07