蛋壳膜对生产肉鸡抗病力和免疫力的影响

方绍培,刘晨龙,尧国荣,朱钱龙,文 虹,邹志恒,熊立根*

(1.江西省农业科学院 畜牧兽医研究所,江西 南昌 330200;2.江西农业工程职业学院,江西 樟树 331200;3.江西省兽药饲料监察所,江西 南昌 330029)

蛋壳膜对生产肉鸡抗病力和免疫力的影响

方绍培1,刘晨龙1,尧国荣2,朱钱龙2,文 虹3,邹志恒1,熊立根1*

(1.江西省农业科学院 畜牧兽医研究所,江西 南昌 330200;2.江西农业工程职业学院,江西 樟树 331200;3.江西省兽药饲料监察所,江西 南昌 330029)

将蛋壳膜按不同比例添加于肉鸡的日粮中,分析了其对肉鸡免疫力和接种禽流感H5N1-H9N2二价疫苗后抗体水平的影响。结果表明：蛋壳膜能够显著提高鸡血清总蛋白和白蛋白浓度以及H5N1-H9N2抗体水平。说明蛋壳膜对鸡的免疫力有增强作用,能够作为一种功能性饲料添加剂用于提高肉鸡的抗病力和免疫力。

蛋壳膜；肉鸡；抗病力；免疫力

蛋壳是种禽场的主要副产品之一,由表面钙化的外壳和外壳下面的一层蛋白膜(壳膜)组成。蛋壳膜(Eggshell Membranes, ESM)是一种主要由胶原蛋白和角蛋白组成的纤维结构蛋白。此外, 蛋壳膜还包括一些具有抗菌、抗氧化和免疫调节功能的蛋白或多肽,比如溶菌酶、转铁蛋白、卵清蛋白、卵黏蛋白和防御素等[1]。其中许多蛋白质在功能上类似于乳蛋白,可以对新生儿出生后起到保护作用,帮助肠道微生物的形成以及肠道的成熟等[2-3]。抗菌多肽不仅可以抵御大部分的细菌和真菌等微生物,还可以发挥佐剂功能,增强对外源抗原的抵抗力[4]。本研究在肉鸡日粮中添加不同量的ESM,分析了ESM对增强肉鸡抗病力的作用；同时通过检测接种禽流感H5N1-H9N2双价疫苗后的抗体水平来分析ESM对肉鸡免疫力的影响,以期为蛋壳膜功能性饲料添加剂探索更广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1实验动物及其饲养

本研究随机选取90日龄左右的地方鸡种修水翻毛鸡,于江西省农业科学院畜牧兽医研究所地方鸡饲养中心进行网上饲养。将实验鸡随机分为4组:对照组、试验组Ⅰ、试验组Ⅱ以及试验组Ⅲ,每组8只鸡,并且每组3个重复。试验组与对照组肉鸡的基础日粮相同,试验组Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别在基础日粮中添加0.25%、0.50%和0.75%的蛋壳膜。使用破碎机对蛋壳膜进行破碎,破碎后蛋壳膜大小为60～80目。

1.2血清样品的采集

首先对试验鸡进行7 d的预饲养,在预饲期的日粮中不添加蛋壳膜。7 d预饲后开始在日粮中添加不同剂量的蛋壳膜进入正式试验。在饲喂试验饲养7 d后对各组肉鸡接种禽流感二价疫苗(H5N1-H9N2),按说明用量与方法接种。于接种疫苗后14 d、21 d和28 d分3次通过翅静脉法进行血液的采集。血液采集后在室温下静置2 h,待析出血清后在离心机内用3000 r/min的转速进行离心,将血清用移液枪吸出至新的1.5 mL离心管内,置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3血清生化指标的检测

本研究所测血清生化指标有血清总蛋白、白蛋白和免疫球蛋白。使用南京建成生物工程研究所的检测试剂盒进行检测。

血清总蛋白采用BCA法进行定量。首先将血清样品用生理盐水稀释50倍,然后按照试剂盒说明书配制好工作液。在96孔V型微量反应板中每孔加入250 μL工作液,然后在空白孔、标准孔和测定孔中分别加入双蒸水、标准品(563 μg/mL)以及待测样本各10 μL,混匀,在37 ℃下孵育30 min,最后使用酶标仪在波长562 nm处测定各孔的吸光度值。总蛋白浓度的计算公式为:总蛋白浓度(μg/mL)=[(测定孔的OD值-空白孔的OD值)/(标准孔的OD值-空白孔的OD值)]×标准品浓度563 μg/mL×样品测试前稀释倍数。

血清白蛋白使用微量酶标仪法进行测定。首先使用生理盐水将血清样品稀释10倍,按照说明书配制好溴甲酚绿工作液。于96孔V型微量反应板中每孔加入250 μL工作液,然后在空白孔、标准孔和测定孔中分别加入双蒸水、标准品以及待测样本各10 μL,混匀,在室温下静置10 min,最后使用酶标仪在波长630 nm处测定各孔的吸光度值。白蛋白含量的计算公式为:白蛋白含量(g/L)=[(测定孔的OD值-空白孔的OD值)/(标准孔的OD值-空白孔的OD值)]×白蛋白标准品浓度3.48 g/L。

血清免疫球蛋白(IgG)使用免疫比浊法进行测定。先在96孔V型微量反应板中每孔加入225 μL试剂R1,然后在空白、标准和测定孔中分别加入2 μL双蒸水、标准液和样品，混匀,在37 ℃下孵育3～5 min,使用酶标仪读取吸光度A0；然后分别加入75 μL试剂R2,在37 ℃下孵育5 min,读取吸光度A1,计算ΔA=A1-A0。使用多点定标曲线logit-log(4p)进行处理,用测定管的ΔA计算IgG含量。

1.4血凝(HA)和血凝抑制(HI)实验

按照常规血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验方法进行禽流感H5和H9抗体的检测,计算每个个体的效价。

1.5实验数据统计与分析

使用EXCEL进行实验数据的整理；使用R软件(https://www.r-project.org/)对实验数据进行统计分析(t检验),显著性阈值设定为P≤0.05。

2 结果与分析

2.1血清总蛋白测定结果

本研究在接种禽流感疫苗后第14、21和28天进行血清总蛋白的测定,结果见图1。

图中“*”表示P≤0.05。下同。

从图1中可以看出：在接种禽流感疫苗14 d后(A),3个添加壳膜试验组的总蛋白浓度均比对照组要高,而且随着壳膜添加量的增加,总蛋白浓度也相应增加,但是差异不显著；接种21 d后(B),3个试验组的总蛋白浓度同样都比对照组高,其中添加0.25%壳膜量的试验组浓度最高；接种28 d后(C),3个试验组的总蛋白浓度仍然比对照组高,且0.25%添加量和0.75%添加量试验组的总蛋白浓度均显著高于对照组的(P=0.039和P=0.02)。说明添加不同量的壳膜能提高血清总蛋白浓度。

2.2血清白蛋白测定结果

从图2可以看出,接种禽流感疫苗后第14、21和28天各试验组的血清白蛋白浓度均比对照组高。具体来说，在接种疫苗14 d后(A),0.25%壳膜添加量试验组的血清白蛋白浓度相对于对照组没有显著提高,而0.50%和0.75%壳膜添加量试验组均有显著提高(P=0.015和P=3.76×10-5)；在接种疫苗21 d后(B),0.25%壳膜添加量试验组的血清白蛋白浓度较对照组没有显著提高,而0.50%和0.75%壳膜添加量试验组均有显著提高(P=0.0041和P=0.0035)；在接种疫苗28 d后(C),0.25%和0.50%壳膜添加量试验组的血清白蛋白浓度较对照组没有显著提高,而0.75%壳膜添加量试验组有极显著提高(P=0.00018)。总体来说,壳膜添加量越多,血清白蛋白浓度越高。

图中“**”表示P≤0.01,“***”表示P≤0.001。下同。

2.3血清免疫球蛋白测定结果

本研究使用免疫比浊法测定血清IgG浓度，计算得到ΔA(即A1-A0)。从表1中可以看到,在免疫接种14 d、21 d和28 d后,3个试验组与对照组间的ΔA均无显著性差异,说明添加壳膜对提高肉鸡血清IgG浓度的作用不明显。

2.4血清禽流感抗体H5N1和H9N2效价测定结果

使用HI和HA的方法进行禽流感抗体的检测,以抗体效价的log2的平均值进行统计分析,结果如图3和图4所示。

表1 试验组与对照组的ΔA平均值

纵坐标为抗体效价的log2计算值。

从图3中可以看出：在接种疫苗14 d后(A),3个试验组的H5N1抗体效价均较对照组没有显著提高；在接种21 d后(B),0.75%壳膜添加组相比于对照组,H5N1抗体效价显著提高(P=0.01944),说明壳膜在接种疫苗21 d后开始起到提高鸡血清H5N1抗体水平的作用；在接种28 d后(C),3个试验组相比于对照组,H5N1抗体效价均有显著提高(P值分别等于0.0121、0.0001968、0.003293)。上述结果说明壳膜能够提高鸡血清H5N1抗体水平,而且其效果随着壳膜添加量(0.75%以内)的增加和使用时间的延长而提高。

从图4中可以看出：在接种疫苗14 d后(A),0.50%和0.75%壳膜添加组的H9N2抗体效价均较对照组显著提高(P=0.006128和P=0.002476)；在接种21 d后(B)和28 d后(C),只有0.75%壳膜添加组的H9N2抗体效价较对照组有显著提高(P=0.01105和P=0.0283)。表明添加低剂量水平的壳膜对H9N2抗体水平的提高作用不大,只有较高剂量(0.75%)的添加量才能提高鸡血清H9N2抗体水平。

纵坐标为抗体效价的log2计算值。

3 讨论

已有研究表明,有生长缺陷的鸡的鸡蛋副产品能够改善家畜的营养水平[7-8]。目前对ESM的利用主要在化妆品[9]、蛋壳膜美容保健奶[10]、中医药(即凤凰衣)[11]以及治疗角膜溃疡[12]等方面,而作为功能性饲料添加剂研究其对家禽抗病力和免疫力的影响尚未见报道。ESM含有大量的免疫调节蛋白或多肽[1,13-14]。从本研究试验结果来推测,ESM作为饲料添加剂对鸡的生理机能具有调节作用,可以作为一种功能性饲料添加剂，用于提高肉鸡的抗病力和免疫力。

在本研究所检测的5个指标(总蛋白、白蛋白、IgG、H5N1效价和H9N2效价)中, ESM除了对提高血清IgG浓度无作用外,对其余4个指标均有不同程度的提高。血清总蛋白与鸡体的免疫功能有着密切的关系；本研究在接种禽流感灭活疫苗后21 d内都未检测到血清总蛋白浓度的提高,只是在接种后28 d检测到有提高,说明ESM对提高接种禽流感疫苗后鸡体内的总蛋白浓度的作用不大。血清白蛋白具有物质结合和转运功能,能结合许多内源性和外源性化合物,与药物、营养物质的给予和疗效、解毒和抗氧化作用密切相关,其能结合的药物有抗生素和免疫抑制剂等[15]。因此鸡体血清白蛋白浓度的增加有利于结合抗生素或免疫抑制剂,减少抗生素对鸡体的影响或者防止鸡体免疫力被抑制。本研究发现,在接种疫苗28 d后,3个试验组的H5N1效价都显著高于对照组的,其中0.50%添加量组的效价最高,说明0.50%的壳膜添加量是合适添加量；另外，蛋壳膜对鸡体内H9N2抗体水平的提高只在接种疫苗后的前期有较明显的作用,随着时间的推移,其作用越来越小。总体来说，蛋壳膜能够提高鸡体H5N1、H9N2抗体水平,抵抗禽流感的感染。

综上所述，蛋壳膜在一定程度上可以增强鸡体的抗病力和免疫力，可以作为一种功能性饲料添加剂用于肉鸡的饲养。但本研究只分析了蛋壳膜对H5N1型禽流感的防御力,是否会对其它型的禽流感具有相同作用,还需进行进一步的研究。

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(责任编辑:黄荣华)

EffectsofEggshellMembraneonDiseaseResistanceandImmunityofChickens

FANG Shao-pei1, LIU Chen-long1, YAO Guo-rong2, ZHU Qian-long2,WEN Hong3, ZOU Zhi-heng1, XIONG Li-gen1*

(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China; 2. Jiangxi Vocational College of Agricultural Engineering, Zhangshu 331200, China; 3. Jiangxi Provincial Institute of Veterinary Medicine and Feed Supervision, Nanchang 330029, China)

Different ratios of eggshell membrane (ESM) was added into the diet of chickens, and the effects of ESM on the immunity of chickens and their antibody level after inoculating avian influenza H5N1-H9N2 bivalent vaccines were analyzed. The results showed that ESM could significantly enhance the concentration of serum total protein and serum albumin, as well as the H5N1-H9N2 antibody level in chickens. Therefore, ESM can strengthen the immunity of chickens, and can be used as functional feed supplement to improve the disease resistance and immunity of chickens.

Eggshell membrane; Chicken; Disease resistance; Immunity

S831.9

A

1001-8581(2017)12-0077-05

2017-08-15

江西省科技计划项目(20151BBF60065)。

方绍培(1972─),男,畜牧兽医师,研究方向为畜禽健康养殖与疾病防治。*通讯作者:熊立根。