乌药不同提取物对酒精性肝损伤大鼠肝脏及小肠组织形态学的干预研究

陈 潮 汤小刚 王军伟 谭明明 楼招欢

·实验研究·

乌药不同提取物对酒精性肝损伤大鼠肝脏及小肠组织形态学的干预研究

陈 潮1汤小刚1王军伟1谭明明1楼招欢2

目的 观察乌药不同提取物对酒精性肝损伤模型大鼠肝脏及小肠组织形态学的影响。方法 实验1：SD大鼠80只，随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、STW组、CTW组、CTC1组、CTC2组、CTC3组，每组10只；除正常对照组（以等体积的蒸馏水灌胃）外，其余各组灌胃法给予1mL/100g白酒，每日2次，连续10天；第l天起，正常组及模型组予相同体积的蒸馏水，其余各组灌胃给予1mL/100g体积的相应药物，每日1次，连续10天。末次给药后处死大鼠并取下肝组织，固定、石蜡包埋、HE染色后观察病理改变。实验2：SD大鼠88只随机分组，组别同实验1，每组11只；除正常对照组（以等体积的蒸馏水灌胃）外，其余各组大鼠均给予酒精体积浓度50%的白酒灌胃造模，每日1次，灌胃容积1.2mL/100g，连续33天；第1天起，正常组及模型组予相同体积的蒸馏水，其余各组灌胃给予1mL/100g体积的相应药物，每日1次，连续33天。末次给药后处死大鼠并取下小肠组织，固定、石蜡包埋、HE染色后观察病理改变。结果 （1）与正常对照组相比，模型组大鼠肝小叶结构受到损伤，其界限较模糊，肝细胞索排列紊乱，散见肝细胞呈点灶状坏死，汇管区可见炎细胞浸润；小肠粘膜呈部分肠上皮细胞变性、坏死，间质轻度水肿，绒毛横径增宽。与模型组相比，乌药各提取部位组大鼠肝脏、小肠组织炎症细胞浸润及坏死程度均降低，病理变化程度明显减轻。（2）乌药不同提取物组对比，乌药醇提取物抗肝及肠道损害优于水提取物；醇提取物中，乌药醇提石油醚萃取物和醇提正丁醇萃取物效果较优。结论 乌药各提取物能明显改善酒精损伤大鼠肝和小肠组织损伤。

大鼠；酒精性肝损伤；乌药提取物；肝脏；小肠；组织学

酒精性肝损伤是常见的致肝硬化原因，目前，我国由于酒精性肝损伤引起的酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，而临床上对酒精性肝损伤的治疗效果较差。乌药是传统常用中药，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、镇痛消炎等作用，临床应用较广。研究[1]表明，乌药有较好保护肝损伤作用和抗氧化作用。本文进一步从组织病理角度探索乌药不同提取物对酒精性肝损伤大鼠肝脏、小肠的保护作用，并对不同提取物的疗效进行比较，以了解乌药保护酒精性肝损伤大鼠肝脏、小肠组织损伤的可能有效成份，现报道如下。

1 材料

1.1 药物与试剂 乌药由浙江省天台山乌药生物工程有限公司提供，经该公司陈方标药师鉴定为樟科（Lauraceae）山胡椒属（Lindera）植物乌药Lindera aggregata（Sims）Kosterm 的干燥块根。联苯双酯（浙江万邦药业股份有限公司），用蒸馏水进行溶解并稀释成0.225mg/mL浓度备用；思密达（博福-益普生（天津）制药有限公司，批号K030407），规格3g×10袋，用蒸馏水配制成浓度为0.09g/mL的混悬液备用。红星二锅头（北京红星股份有限公司生产，酒精度为52%），按一定比例稀释。

1.2 实验动物 实验1：健康SD大鼠80只，雌性，体质量 170～200g，动物质量合格证号：0007718；实验2：健康SD 大鼠88只，雌性，体质量 180～220g，动物质量合格证号：0016074；均采购自浙江省实验动物中心。

2 实验方法

2.1 乌药水提取物制备 取乌药适量，加入12BV水提取1.5h，滤取药液，药渣继用10BV水提取1h，滤取药液，合并2次药液，减压回收并适当浓缩，即得乌药水提取物（STW）。乌药醇提取物制备：取乌药适量，加入12BV75%乙醇提取1.5h，滤取药液，药渣继用10BV乙醇提取1h，滤取药液，合并两次药液，减压回收并适当浓缩，即得乌药醇提取物（CTW）。乌药醇提取物各萃取物：取乌药醇提取物适量，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇，分次萃取至色淡，分取并合并各萃取层，减压回收溶剂，分别得乌药醇提取物石油醚萃取物（CTC1）、乌药醇提取物乙酸乙酯萃取物（CTC2）、乌药醇提取物正丁醇萃取物（CTC3）。取乌药醇提取物各萃取物，用适量吐温80研磨后，加水置磁力搅拌器上混匀，加纯水稀释，使每毫升药液相当于1g生药，即得各萃取物溶液。上述各溶液，临用前用适量纯水稀释，使每毫升药液相当于0.5g生药。

2.2 动物处理 所有实验大鼠均喂基础饲料，自由饮水和采食。实验1：SD大鼠80只随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组（联苯双酯2.25mg/mL）、STW 组、CTW 组、CTC1 组、CTC2 组、CTC3 组，每组10只。除正常对照组（以等体积的蒸馏水灌胃）外，其余各组大鼠灌胃法给予1mL/100g不同酒精浓度的白酒（酒精体积浓度逐渐从30%递增至50%）每日2次，连续10天[1]，具体为：第1～2天灌胃给予酒精体积浓度为30%的白酒，第3～4天增加至40%，第5～10天增加至50%，持续灌胃至第10天；灌胃第1天起，灌胃法给予正常组及模型组相同体积的蒸馏水，其余各组灌胃给予1mL/100g体积的相应药物，每日1次，连续10天，末次给药后处死大鼠并取下肝脏，称取新鲜肝脏0.5g制取10%的肝匀浆。实验2：SD大鼠88只随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组（思密达0.09g/mL）、STW组、CTW组、CTC1组、CTC2组、CTC3组，每组11只。除正常对照组（以等体积的蒸馏水灌胃）外，其余各组大鼠均给予酒精体积浓度50%的白酒灌胃造模，每日1次，灌胃容积1.2mL/100g，连续33天造模结束[2]；灌胃第1天起，灌胃法给予正常组及模型组相同体积的蒸馏水，其余各组灌胃给予1mL/100g体积的相应药物，每日1次，连续33天，末次给药后处死大鼠并摘取小肠。

2.3 组织处理 实验1大鼠取肝脏左叶，实验2大鼠取回盲部上方15cm处小肠，用10%中性甲醛对组织进行固定及石蜡包埋，HE染色后于显微镜下观察各组织的病理改变。

3 结 果

3.1 对酒精性肝损伤模型大鼠肝脏组织形态学的影响 肉眼观察，正常组大鼠肝脏组织色泽正常，腹腔肠管间无粘连；模型组大鼠肝脏颜色稍微变黄，腹腔内肠管之间出现粘连。光镜下观察可见正常组肝脏的肝小叶结构完整，肝细胞呈放射状排列，肝细胞轮廓清晰，无坏死；模型组大鼠肝脏肝小叶结构受到损伤，其界限较模糊，肝细胞索排列紊乱，散见肝细胞呈点灶状坏死，汇管区可见炎细胞浸润；与模型组相比，阳性对照组及乌药各提取部位组大鼠肝脏炎症细胞浸润及坏死程度均降低，其肝组织病理变化程度明显减轻。其中，乌药醇提取物组优于水提取物组；而在醇提取物中，乌药醇提石油醚萃取物和醇提正丁醇萃取物效果较优，见图1（封底）。

图1 肝组织病理学（HE染色，×400）

3.2 对酒精性肝损伤模型大鼠小肠组织形态学的影响 光镜下可见正常对照组大鼠小肠黏膜上皮细胞形态及结构正常，微绒毛整齐、密集，无缺损；模型对照组大鼠小肠黏膜呈部分肠上皮细胞变性、坏死、脱落，间质轻度水肿，少量炎细胞浸润，绒毛横径增宽。与模型对照组相比，阳性对照组及乌药各给药组大鼠小肠组织病理变化程度明显减轻。其中，乌药醇提取物组优于水提取物组；而在醇提取物中，乌药醇提石油醚萃取物和醇提正丁醇萃取物效果亦较优，见图 2（封底）。

图2 小肠组织病理学（HE染色，×100）

4 讨论

现代医学认为，长期的酒精摄入可导致肠黏膜通透性增高，使过多内毒素通过血液循环损伤肝脏[3]，这是酒精性肝损伤的发病机制之一。Tamai等[4]用20%酒精胃内灌注大鼠，4h后观察到近端小肠糜烂出血和上皮细胞缺失，证明了酒精可导致肠黏膜损伤。聂娇等[5]通过酒精摄入诱导酒精性肝损伤动物模型也发现酒精组血清内毒素水平明显高于对照组，对肠形态学的观察可发现肠黏膜有明显损伤。酒精作为肝脏毒剂，可削弱正常肝细胞的代谢及结构稳定，损伤线粒体功能，同时又可致小肠黏膜通透性增加，屏障功能减弱，肠道细菌过度生长，产生大量内毒素[6-7]，导致肠源性内毒素渗漏形成二次攻击加重肝损伤。

药理研究表明，乌药对消化系统、心血管系统、免疫系统、中枢神经系统以及抗病毒等方面具有广泛的药理活性[8-9]。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型对照组大鼠光镜下肝脏肝小叶结构受到损伤，其界限较模糊，肝细胞索排列紊乱，散见肝细胞呈点灶状坏死，汇管区可见炎细胞浸润,小肠黏膜呈部分肠上皮细胞变性、坏死，间质轻度水肿，绒毛横径增宽，均提示造模成功。与模型组相比，阳性对照组及乌药各提取部位组大鼠光镜下肝脏及小肠炎症细胞浸润及坏死程度均降低，组织病理变化程度明显减轻,实验表明乌药有明显的减轻酒精对肝脏及小肠的损害作用，结合文献[10]复习，考虑乌药通过保护小肠组织，减轻肠源性内毒素血症，从而起到保肝组织作用；同时醇提取物抗损伤作用优于水提取物，且在醇提取物三个萃取部位中，乌药醇提石油醚萃取物和醇提正丁醇萃取物效果较优。虽然目前无法得知乌药作用的具体有效成分及药效部位，但可推知乌药保肝、小肠成分主要存在于乌药醇提取物及其石油醚萃取物和正丁醇萃取物中。

［1］陈卓亮，王军伟，谭明明，等.乌药水提物与醇提物对急性酒精性肝损伤模型大鼠抗氧化作用的比较研究［J］.浙江中医杂志，2015，50（6）：414-415.

［2］赵初环，卢中秋，李惠萍，等.大鼠酒精性肝病模型的建立［J］.浙江临床医学，2007，9（4）：435-436.

［3］ Schaffert CS，Duryee MJ，Hunter CD，et al.Alcohol metabolites and lipopolysaccharide：rolesin the development and/or progression of alcoholic liver disease［J］.World J Gastroenterol，2009，15（10）：1209-1218.

［4］ Tamai H，Kato S，Horie Y，et al.Effect of acute ethanol administration on the intestinal absorption of endotoxin in rats［J］.Alcohol Clin Exp Res，2000，24（3）：390-394.

［5］聂娇，李鑫，崔培林，等.IGF-1在酒精性肝病伴发肠粘膜损伤中的作用探讨［J］.实用肝脏病杂志，2012，15（4）：305-308.

［6］Tang Y，Forsyth CB，Keshavarzian A.The role of miRNAs in alcohol-induced endotoxemia，dysfunction of mucosal im －munity，and gut leakiness［J］.Alcoholism，clinical and experimental research，2014，38（9）：2331-2334.

［7］Rao RK，Seth A，Sheth P.Recent advances in alcoholic liver disease.Role of intestinal permeability and endotoxemia in alcoholic liver disease［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2004，286：G881-G884.

［8］王军伟，阮冰.乌药的植化及药理研究概况［J］.浙江中医杂志，2006，41（11）：675-677.

［9］陈方亮，余翠琴.乌药的药理研究概况［J］.海峡药学，2011，23（12）：44-46.

［10］Wang JW，Chen XY，Hu PY，et al.Effects of linderae radix extracts on a rat model of alcoholic liver injury［J］.Experimental and Therapeutic Medicine，2016，11（6）：2185-2192.

ACC向国际媒体宣布：中医药可有效治疗心血管疾病

6月20日，《美国心脏病学会杂志》刊发山东大学齐鲁医学院张运院士和赵玉霞教授团队应邀撰写的综述文章。文章评价了中医药治疗心血管疾病的安全性和有效性，提出对于心血管疾病一级和二级预防某些中医药可作为现代医学的替代和补充治疗，但尚需要更严格的随机临床试验以验证中医药对心血管疾病患者总死亡率和主要心血管事件的长期影响。

为完成此次约稿，研究团队经过1年时间，在2006-2016年的近千篇文献中，按照国际标准筛选出56篇高质量随机双盲临床研究，根据证据强度和研究质量将这些研究进行分组，系统分析了多种心血管疾病临床试验的中医药疗法、对比疗法、观察终点、治疗前后终点改变。此外，文章系统分析了中药有效成分多酚、萜类、皂苷类和生物碱治疗心血管疾病的药理学作用、可能的分子机制以及基础研究采用的细胞和动物模型。

美国心脏病学会（ACC）在其向国际媒体发布的官方新闻中指出，文章中收集的研究证明中医药对于一些心血管疾病具有益处，这对于那些不能耐受或经济上不能负担西药的患者是一个很好的替代疗法。

赵玉霞教授指出，虽然中药处方大多为复方，且医师常依据个体化原则自行组方，但传统中医药某些活性成分的药理学作用及分子机制已被阐明，对于心血管的一级和二级预防，某些中药有可能成为补充或替代疗法。

（引自中国医学论坛报）

Effect of Extracts from Radix linderae on the Morphology of Liver and Intestinal Tissue in Rats with Al－coholic Liver Disease

CHEN Chao1,TANG Xiaogang1,WANG Junwei1,TAN Mingming1,LOU Zhaohuan2.
1Department of Gastroenterology；2Department of Emergency Medicine,People's Hospital of Tiantai Zhejiang,Tiantai(317200),China;3Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

Objective To investigate the effect of different extracts from Radix linderae on the morphology of liver and intestine of alcoholic liver disease（ALD） rats.Methods The 1st experiment:Eighty SD rats were randomly divided into blank,model,control,STW,CTW,CTC1,CTC2,CTC3 groups,with 10 rats in each group.Except for blank group（equivalent volume of distilled water）,other groups were given wine（1mL/100g）,twice a day,for 10 days.From day 1,except for blank and model groups（equivalent volume of distilled water）,other groups were administered with the corresponding drugs,1mL/100g,once a day,for 10 days.At the end of the treatment all rats were sacrificed to collect the liver tissue for HE staining observation.The 2nd experiment:Eighty eight SD rats were randomly divided into the same groups as in the 1st experiment,with 11 rats in each group.Except for blank group （equivalent volume of distilled water）,other groups were given wine of volume concentration of 50%alcohol by gavage,1.2mL/100g,once a day,for 33 days.At the end of the treatment all rats were sacrificed tocollect the intestinal tissue for HE staining observation.Results The histological observation of the liver in rats with ALD showed damaged hepatic lobules,abnormal hepatic cords,scattered spotted and focal necrosis,and inflammation in portal area;the histology of the intestine of ALD rats showed degeneration and apoptosis of epithelial cells,interstitial edema,and enlarged villi.Compared with model group,the injuries of the liver and intestinal tisues of rats treated with extracts from Radix linderae were significantly attenuated.This effect was more obvious with alcohol extract than with aqueous extract from Radix linderae.The best two alcohol extracts from Radix linderae were mineral ether extract and n-butyl extract.Conclusion Different extracts from Radix linderae can obviously reduce the liver and intestine damage in rats with ALD.

rats;alcoholic liver disease;extracts from Radix linderae;liver;intestine;histology

浙江省科技厅公益性技术应用研究计划（No.2013C33222）；台州市科技计划（No.2014A33339）；国家自然科学基金青年项目（No.81503328）；浙江省医药卫生平台计划（No.2015DTA021）；浙江省科技厅公益性技术应用研究计划（No.2016C33184）。

1浙江省天台县人民医院消化内科（陈潮、汤小刚），急诊医学科（王军伟、谭明明）（天台 317200）；2浙江中医药大学（杭州 310053）

王军伟，E-mail：901086@163.com，Tel：13758605567

（收稿：2017-03-26 修回：2017-07-05）