脑梗死患者血浆中同型半胱氨酸、维生素B12与叶酸表达水平研究

孙贵祥，朱建建，马伯恒，高跃强

脑梗死患者血浆中同型半胱氨酸、维生素B12与叶酸表达水平研究

孙贵祥，朱建建，马伯恒，高跃强

目的：探讨脑梗死患者血浆中同型半胱氨酸、维生素B12与叶酸表达水平与血管性痴呆的关系。方法：采用高效液相色谱法检测受试者（脑梗死患者血管性痴呆组、脑梗死患者非痴呆组、健康对照组）血浆Hcy、维生素B12及叶酸水平，并观察MTHFR基因型在不同组间分布情况。结果：血管性痴呆组的血浆Hcy水平明显高于非痴呆组、健康对照组（P＜0.05），而维生素B12及叶酸水平明显低于非痴呆组和健康对照组（P＜0.05）。不同病情严重程度脑梗死血管性痴呆患者间Hcy、维生素B12及叶酸水平无统计学差异（P＞0.05）。MTHFR基因型在各组间分布情况差异也无统计学意义（P＞0.05）。结论：血浆中Hcy、维生素B12及叶酸水平可能与血管性痴呆有关。

血管性痴呆；同型半胱氨酸；维生素B12；叶酸

血管性痴呆是老年期常见的认知障碍疾病之一，发病率仅次于阿尔兹海默病，常与阿尔兹海默病共存，有时甚至对阿尔兹海默病病情有加重作用，故对于血管性痴呆的临床研究更具实际意义[1,2]。迄今为止，有关血管性痴呆的病理机制尚未明确[3]。多数学者认为脑梗死为血管性痴呆发病的主要原因[4]。血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）的升高易导致人体脑血管发生病变，进而引发脑功能衰退、脑梗死等[5]。影响Hcy体内浓度的因素除N5,N10-亚甲四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）外，维生素B12及叶酸对Hcy的代谢过程也有一定影响[6,7]。为进一步研究血管性痴呆病理机制，本文对Hcy、维生素B12与叶酸表达水平与脑梗死患者血管性痴呆的关系进行探讨，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年～2015年我科收治的住院患者，脑梗死患者血管性痴呆组的纳入标准：在脑血管病发生后3～6月，患者自述出现认知功能障碍或记忆力减退者；依据Roman研究标准[8]，根据长谷川痴呆量表、蒙特利尔认知评估量表、简易精神状态检查表及Hachinski缺血量表对患者评估做出血管性痴呆的诊断，患者长谷川痴呆量表得分≥7分，蒙特利尔认知评估量表得分≤26分，简易精神状态检查表得分≤26分，Hachinski缺血量表得分≥7分；经脑核磁共振检测显示，患者脑白质、脑皮质以及双侧基底核出现多发性、长T2或长T1病灶；经脑CT检查发现患者基底核区、大脑白质出现多发或单发性腔隙梗死，脑室周围出现缺血性白质疏松。脑梗死患者非痴呆组纳入标准：患者的脑核磁共振检测以及脑CT检测均符合第四届全国脑血管病会议制定的脑梗死诊断标准[9]；经长谷川痴呆量表、蒙特利尔认知评估量表、简易精神状态检查表及Hachinski缺血量表测试未出现痴呆；与脑梗死患者血管性痴呆组同期入院接受治疗。健康对照组纳入标准：经脑核磁共振检测及脑CT检测未见脑梗死病灶；经长谷川痴呆量表、蒙特利尔认知评估量表、简易精神状态检查表及Hachinski缺血量表测试未出现痴呆。排除标准：甲状腺功能减退；有抑郁症、躁狂症等中枢神经系统疾病；服用改善认知、抗抑郁及抗癫痫的药物；服用维生素B12、维生素B6及叶酸；伴严重肝、心、脑、肾及血液性疾病。入选者对本研究知情，且自愿签署知情同意书。最终血管性痴呆组纳入42例，其中男22例，女20例；年龄 61～74岁，平均（65.1±3.4）岁；根据简易精神状态检查表评分情况将其进一步分为轻度（20～26分）13例、中度（10～20分）15例、重度（＜10分）14例。非痴呆组纳入40例，其中男21例，女19例；年龄60～75岁，平均（66.7±5.6）岁。健康对照组30例，其中男16例，女14例；年龄 60～76岁，平均（64.9±3.8）岁。各组间性别、年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血浆中Hcy、维生素B12及叶酸浓度检测 于入院次日清晨空腹采集入选者肘静脉血4 mL，分离血浆后采用高效液相法对血浆中Hcy、维生素B12及叶酸进行检测。具体检测步骤按文献[10-12]所述方法进行：①Hcy：流动相为50 mmol/L磷酸二氢钾-50 ml/L甲醇，流速为1.0 mL/min，采用脉冲电流检测器检测；②维生素B12：流动相为0.03 mmol/L磷酸二氢钾-乙腈（85∶15），流速为1.0 mL/min，采用紫外检测器检测，波长为361 nm；③叶酸：流动相为0.1%甲酸水-乙腈（85∶15），流速为1.0 mL/min，采用质谱检测器检测。

1.2.2 MTHFR基因型检测 于入院次日清晨空腹采集入选者肘静脉血4 mL，参照文献[13]方法提取DNA。引物序列为 5’-TGA AGG AGA TGT CTG CGG GA-3’和5’-AGC ACG GTG CGG GAG TG-3’，购置于中科院上海细胞研究所。PCR系统具体条件为：94℃30 s，62℃45 s，72℃50 s，30个循环后采用72℃延伸 10 min。

1.3 统计学处理

采用SPSS19.0软件包进行统计学分析，计量数据以（平均值±标准差）表示，t检验；计数数据采用百分比[n(%)]表示，χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHFR基因型鉴定

MTHFR基因经PCR扩增后产生198 bp片段（图1A）。该位点为C/T二态SNP。PCR扩增产物经酶切后产生175 bp和23 bp两种长度片段，故可以分出三种基因型：未突变纯合子C/C，可见一条电泳带为198 bp；突变纯合子T/T，可产生175 bp和23 bp两种片段；突变杂合子C/T，可见3条电泳带，分别为198 bp、175 bp和23 bp（图1B）。

图1 MTHFR基因型鉴定

2.2 不同组间Hcy、维生素B12及叶酸水平比较

血管性痴呆组血浆Hcy水平明显高于非痴呆组和健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），维生素B12及叶酸水平明显低于非痴呆组和健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 不同病情严重程度血管性痴呆患者中Hcy、维生素B12、叶酸及水平比较

不同病情严重程度的血管性痴呆患者血浆Hcy维生素B12及叶酸水平间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.4 MTHFR基因型在不同组间分布情况

不同组间MTHFR基因型差异无统计学意义（P＞0.05），且等位基因频率差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表1 不同组间Hcy、维生素B12及叶酸水平比较

表2 不同病情严重程度血管性痴呆患者中Hcy、维生素B12、叶酸水平比较

表3 MTHFR基因型在不同组间分布情况

3 讨论

血管性痴呆是仅此于阿尔兹海默症的第二位常见的持续性、获得性认知功能障碍综合征，根据病理特点及临床特征主要分为大面积梗死性痴呆、多发梗死性痴呆、分水岭区梗死性痴呆、单个重要部位梗死性痴呆等7种类型[14]。有关血管性痴呆的发病机制至今尚未有明确定论。学者认为炎性反应、胆碱能通路抑制、血管内皮损伤、缺血再灌损伤、遗传因素等均有可能引发血管性痴呆[15]。而大多数学者认为，脑梗死是造成患者血管性痴呆的最重要因素。

不少研究表明血浆中Hcy浓度与脑梗死具有一定相关性，脑梗死患者血浆内Hcy水平明显高于正常组，Hcy成为脑梗死的独立危险因素[16,17]。本研究结果显示，血管性痴呆组及非痴呆组患者血浆中Hcy水平高于健康对照组（P＜0.05）,血管性痴呆组的血浆Hcy水平高于非痴呆组（P＜0.05），提示Hcy水平升高可能也是血管性痴呆的危险因素。而高Hcy引发患者出现脑梗死及血管性痴呆的可能机制为：①血管内皮损伤：体内过氧化氢以及氧自由基易造成血管内皮细胞损伤，Hcy化的蛋白质进而结合相应抗体，免疫性攻击血管内皮，造成内皮损伤，动脉粥样硬化，增加脑梗死发率[18]；②Hcy通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体及其亚型，激发氧自由基的产生以及钙离子的超载，进而对毒物介导的细胞外毒作用起到兴奋作用，同时促进神经细胞的凋亡，最终对神经传导功能造成危害[19]。③Hcy参与S-腺苷代谢过程，抑制S-腺苷的分解，引发磷脂及蛋白质的甲基化过程受阻、单胺类神经递质的代谢中断，造成海马神经元死亡，损伤患者记忆及认知能力[20]。

由于人体内Hcy的甲基化代谢过程需在维生素B12以及叶酸的催化下完成，一旦体内叶酸、维生素B12水平降低，就会导致Hcy甲基化过程受阻，进而引起血浆中Hcy水平升高。此外，MTHFR也是体内叶酸代谢的关键酶，在DNA甲基化、叶酸代谢及DNA修复中起重要作用。当MTHFR基因中677位点处发生C-T突变时，MTHFR酶的活性会显著降低[21]，进而影响Hcy代谢过程，造成血浆Hcy水平升高。因此，为全面考察血管性痴呆患者体内Hcy的累积原因，本研究对患者维生素B12、叶酸水平及MTHFR基因进行监测。结果显示，血管性痴呆组及非痴呆组患者血浆中维生素B12及叶酸水平显著低于健康对照组（P＜0.05），血管性痴呆组的血浆维生素B12及叶酸水平明显低于非痴呆组（P＜0.05），说明维生素B12以及叶酸水平降低，Hcy代谢途径受阻，体内Hcy水平升高，易造成血管性痴呆。但观察不同组间MTHFR基因型差异时发现，不同组别间基因型以及等位基因频率差异无统计学意义（P＞0.05），可能由于实验例数较少所致。

研究不同病情严重程度血管性痴呆患者体内Hcy、维生素B12以及叶酸水平差异时发现，轻度、中度及重度患者体内三指标差异无统计学意义（P＞0.05），说明体内Hcy、维生素B12及叶酸水平变化与血管性痴呆的病变程度关系较小。

综上所述，脑梗死血管性痴呆患者体内Hcy水平高于无痴呆性脑梗死患者及健康志愿者，维生素B12及叶酸水平低于无痴呆性脑梗死患者及健康志愿者，增加叶酸及B族维生素的摄入或可有助于预防脑梗死血管性痴呆的发生。

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Study on Plasma Homocysteine,Vitamin B12,Folic Acid Levels in Cerebral Infarction Patients

SUN Gui-xiang,ZHU Jian-jian,MA Bo-heng,GAO Yue-qiang.Department of Neurology,Rugao People's Hospital,Jiangsu 226500,China

Objective:To investigate relations between plasma homocysteine,vitamin B12,folic acid levels and vascular dementia in cerebral infarction patients.Methods:The plasma homocysteine,vitamin B12,folic acid levels of vascular dementia group,non-infarct dementia group and health control group were analyzed by using HPLC.The polymorphisms of methylenetetrahydrofolate(MTHFR)reductase gene in different group were also observed.Re⁃sults:The plasma homocysteine levels of vascular dementia group were much higher than those of non-infarct dementia group and health control group(P＜0.05),while the vitamin B12,folic acid levels of vascular dementia group were much lower than those of non-infarct dementia group and health control group(P＜0.05).There were no significant differences in level of homocysteine,vitamin B12and folate between different level of vascular dementia group(P＞0.05).The polymorphisms of MTHFR reductase gene in the different groups showed no significant differences(P＞0.05).ConclusionThe plasma homocysteine,vitamin B12,and folic acid levels have relations with vascular dementia.

vascular dementia;plasma homocysteine;vitamin B12;folic acid

R741;R741.02;R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.06.011

如皋市人民医院神经内科江苏 如皋 226500

2016-11-16

孙贵祥jhmali100@163.com

（本文编辑：王晶）