金铁锁不定根培养体系建立

， ， ， 济红(贵州省生物研究所， 贵阳 550009)

金铁锁不定根培养体系建立

席培宇，王虹，刘燕，王济红
(贵州省生物研究所， 贵阳 550009)

目的：研究金铁锁不定根培养体系，为规模化生产金铁锁提供技术支持。方法：通过组织培养，以金铁锁植株幼茎为外植体，建立芽增殖体系，成功诱导新芽分化产生不定根，建立了金铁锁不定根培养体系。结论：成功建立金铁锁不定根离体培养体系，对进一步规模化培养金铁锁不定根具有重要意义。

金铁锁； 组织培养； 不定根

金铁锁(Psammosilenetunicoides)是石竹科金铁锁属植物，是我国中成药保密品种“云南白药”的重要成分之一[1-2]。据《中华本草》记载，金铁锁以根入药，具有散瘀止痛、消痈排毒和祛风湿的功效，可治风湿痹痛，创伤出血，跌打损伤，筋骨疼痛和蛇咬伤等症[3]。现代研究证明，金铁锁主要化学成分为三萜类皂苷[4]、环肽[5]以及内酰胺等[6-8]，根部主要药用成分总皂苷有镇痛、抗炎、止血、免疫调节等多种药效作用[9-11]。除云南白药系列外，金铁锁还是多种知名中成药的主要配药，如百宝丹系列、贵州金骨莲胶囊、云南红药胶囊等[12-13]。金铁锁作为我国西南地区的道地药材和特有的单属种植物，国内外相关研究报道较少，目前对其研究主要集中在化学成分[14-16]、药理作用[9-11]、生物学特性[17-18]等方面，繁育技术[19-24]和栽培技术[25-28]研究报道还相对较少。

当前，采用“毛状根”[29]、“不定根”[30]等生物技术定向培养植物细胞或器官来获取次生代谢产物，是珍稀濒危药用植物资源可持续开发利用研究的热点和有效途径。如王颖芳等发现，发根农杆菌诱导南方红豆杉产生的毛状根中可产生紫杉醇，可作为紫杉醇的主要来源[31]；刘峻等研究人参毛状根时发现，人参总皂苷含量是原药材的1.7倍[32]；步怀宇等研究发现，滇黄芩毛状根中黄芩苷是原药材的7.18倍[33]。金铁锁“毛状根”培养也有少量报道[34-36]。李景滨等[36]利用发根农杆菌成功诱导金铁锁产生毛状根，并发现金铁锁毛状根生物量增加了14.11倍，总皂苷是原植物的4倍。虽然通过毛状根培养技术能明显提高金铁锁总皂苷含量，但目前的研究还处于初级阶段，且存在转基因不明成分的风险。金铁锁不定根培养技术与毛状根不同，不定根不仅有生长速率快、遗传稳定、激素自养等特点，最重要的是它不需要发根农杆菌诱导，直接通过调节培养基激素种类或配比，通过组织培养就能诱导产生，不存在转基因问题。因此本研究拟建立的金铁锁“不定根培养”技术体系，可作为当前解决金铁锁资源紧缺，市场需求旺盛供需矛盾突出的有效途径之一。

1 材料与方法

1.1 材 料

金铁锁植株盆栽于贵州省生物研究所试验大棚，取其幼嫩茎段作为试验材料。

1.2 方 法

将试验材料经自来水冲洗干净后用高锰酸钾溶液浸泡30 min左右，然后用自来水冲洗干净，在超净工作台上用升汞处理8～10 min，无菌水冲洗3～5遍，用无菌滤纸吸去表面水分后，切成1 cm左右茎段。

选用1/2 MS培养基附加30 g/L蔗糖，12 g/L琼脂，1 g/L活性炭，1 g/L PVP为基本培养基，通过添加不同比例的激素组合，在24 ℃和12 h/d光照周期下进行芽诱导培养、芽增殖培养及其不定根诱导。

2 结果与分析

2.1 芽诱导培养基的筛选

将处理后的金铁锁茎段分别接种到2,4-D、NAA和KT不同激素组合的培养基上，3 d后可见金铁锁茎基部开始膨胀，6 d后茎段腋芽处开始萌动，随着培养时间的推移，腋芽逐渐伸长并长出新茎叶。14 d后统计新生芽诱导率，结果(见表1)表明，金铁锁茎段在不同诱导培养基上均可以生长并长出新茎叶，但不同激素组合对外植体的芽诱导能力不同。在2,4-D 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.3 mg/L中，苗生长状态及茎间高度最理想，获得的诱导苗最适合继代增殖。

表1 不同植物激素组合对金铁锁芽诱导的影响

激素组合编号激素浓度(mg/L)2，4⁃DNAAKT外植体个数(个)新生芽数量茎节间长度新生芽生长情况A10．20．10．340多适中茎节粗且间距适中，分枝少，长势好。A20．20．10．540较多短茎节粗且间距短，分枝多，长势好。A30．20．11．040少长茎节细长，新生芽分枝少，长势一般。

表2 不同植物激素组合对无菌苗继代增殖的影响

激素浓度(mg/L)2，4⁃DNAAKT外植体个数(个)新生芽个数(个)增殖系数生长状况0．50．10．340521．300．50．10．540691．730．50．11．040561．400．50．50．340751．880．50．50．540972．430．50．51．040681．70丛生芽分枝较多，长势好；随说KT浓度增加，新芽叶片逐渐变浅至出现玻璃化现象并分泌出红色代谢物；丛生芽分枝多，长势好；随说KT浓度增加，新芽叶片逐渐变浅并出现玻璃化现象；

2.2 芽增殖培养基的筛选

在新生芽成功诱导后，从茎节基部长出丛生芽并渐渐伸长。待苗长至1～3 cm时，就可以进行继代增殖培养。增殖培养中激素为2,4-D与NAA和KT的不同组合，培养14 d后统计侧芽增殖系数，结果见表2。在金铁锁组培苗增殖过程中发现，随着KT浓度增大，芽增殖系数不断升高，但KT浓度不宜过高，浓度过高反而出现增殖的抑制及组培苗玻璃化现象，有些组培苗甚至还分泌出红色的代谢物。此外，本试验还发现，随着2,4-D浓度增加，继代苗愈伤组织形成率越高，不适合后期诱导不定根试验。

由此可见，1/2 MS+2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L培养基最利于金铁锁组培苗的继代增殖，生长高度适中，有较好的增殖系数(2.43倍)，愈伤组织形成率低，组培苗的叶色浓绿，茎粗，非常适宜诱导不定根培养。

注：a为启动培养基上的接种；b为A 1激素组合诱导苗；c为A 2激素组合诱导苗；d为A 3激素组合诱导苗。图1 不同激素组合对芽诱导的影响

2.3 不定根诱导培养基的筛选

以第2代继代茎段较粗的无菌苗为试验材料，取其幼嫩茎段切成1 cm左右作为外植体，分别考察不同浓度的IBA和NAA对不定根诱导的影响。NAA和IBA分别设0.05，0.1，0.3，0.5 mg/L 4个浓度，结果见表3、表4。结果表明，IBA对诱导不定根的分化和生长起着关键作用。当IBA浓度为0.1 mg/L时，不定芽14 d后就形成不定根并快速生长，而在平衡浓度NAA的培养基上，丛生苗分支较多，但生长缓慢、不定根诱导率过低、主根分枝少，诱导时间长，不适合不定根的诱导；当IBA浓度提高至0.3 mg/L时，也有根的生成，但生根较晚，且无明显主根生成，生根率较低；当IBA浓度升高至0.5 mg/L时，没有不定根生产，但也会产生愈伤组织，说明高浓度IBA有利于愈伤组织的形成(图3)。综上所述，金铁锁组培苗不定根诱导的最佳培养基为1/2 MS+IBA 0.1 mg/L。

注：a，b为KT浓度较低时促进苗的增殖；c，d为KT浓度较高时抑制苗的生长，出现玻璃化甚至分泌红色代谢物。图2 不同KT浓度配比对无菌苗增殖的影响

注：a为NAA 0.05 mg/L诱导苗；b为NAA 0.1 mg/L诱导苗；c为NAA 0.3 mg/L诱导苗；d为NAA 0.5 mg/L诱导苗。图3 不同浓度NAA对茎段诱导不定根的影响

注：a为IBA 0.05 mg/L诱导苗；b为IBA 0.1 mg/L诱导苗；c为IBA 0.3 mg/L诱导苗；d为IBA 0.5 mg/L诱导苗。图4 不同浓度IBA对茎段诱导不定根的影响

表3 不同浓度NAA对无菌苗诱导不定根的影响

NAA浓度(mg/L)接种不定芽数(个)产生不定根的不定芽数(个)不定根的生根率(%)根生长状况0．05401230不定根诱导率低，主根分枝少，诱导时间长。0．1402153不定根诱导率不高，主根分枝少，诱导时间长。0．34025不定根诱导率太低，主根分枝少，诱导时间长。0．54000没有不定根产生，但有愈伤组织形成。

表4 不同浓度IBA对无菌苗诱导不定根的影响

IBA浓度(mg/L)接种不定芽数(个)产生不定根的不定芽数(个)不定根的生根率(%)根生长状况0．05403178不定根诱导率较高，长势好。0．1403895不定根诱导率高，生长较快。0．3401640不定根诱导率高，但根较细，长势一般。0．54038没有不定根产生，但有愈伤组织形成。

3 结论与讨论

当前金铁锁资源利用多以野生资源为主，人工栽培利用多采用种子繁殖[37-39]。贵州省威宁、毕节等高寒贫困山区是金铁锁野生资源集中分布区之一，由于长期掠夺性采挖，野生资源濒于绝灭，现有实生苗人工栽培繁殖周期要3年以上才能利用，还存在茎、叶生长过剩，根部生长缓慢和药用成分含量低等问题。本研究通过组织培养手段，建立了简便、安全、高效的金铁锁不定根培养技术体系。金铁锁外植体启动诱导培养基为1/2 MS+2,4-D 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.3 mg/L，腋芽出芽率高，不定芽长势好；调整生长素2,4-D和KT的浓度比，得出添加2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L的1/2 MS培养基有利于组培苗的继代增殖，芽苗长势好，健壮质量高；取生长健壮的继代组培苗移至1/2 MS+IBA 0.1 mg/L培养基中诱导不定根，生根率高达95%，长势良好。柴素真[30]等通过金铁锁茎段诱导出愈伤组织，再以愈伤组织为外植体诱导不定根，最后检测出不定根中总皂苷重量的百分含量大约是金铁锁原药材的2倍。本试验只选用了少量激素简单配比且取得了较好的试验效果，简化了培养基成分，相较于柴素真等研究结果，简化中间诱导愈伤组织的步骤，过程更简单，操作更简便，效率更高，这为不定根由摇瓶放大到生物反应器的培养提供了技术参数，为将来通过组织培养技术规模化生产金铁锁不定根替代原料植物夯实了基础，为金铁锁特色植物资源可持续开发利用建立了新的途径。

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(本栏目责任编辑：周忠燕)

The Adventitious Roots Develop System ofPsammosilenetunicoides

XIPeiyu,WANGHong,LIUYan,WANGJihong

2016-09-30

席培宇(1987—)，女，硕士，助理研究员；主要从事贵州特色植物资源引种栽培及繁殖技术研究；E-mail：759076048@qq.com。

王济红(1969—)，女，研究员；E-mail：1821877303@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.02.131

S 567

A

1001-4705(2017)02-0131-04