右美托咪定对神经病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表达的影响*

秦梦婷，邱忠鹏，王业忠

（石河子大学第一附属医院 1.重症医学一科，2.骨二科，新疆 石河子 832008）

右美托咪定对神经病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表达的影响*

秦梦婷1，邱忠鹏2，王业忠1

（石河子大学第一附属医院 1.重症医学一科，2.骨二科，新疆 石河子 832008）

目的探讨右美托咪定对神经病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表达的影响。方法90只健康成年雄性Wistar大鼠随机分为假手术组（n=30）、神经病理性痛组（n=30）和右美托咪定组（n=30），利用坐骨神经结扎的方法复制神经病理性痛模型，右美托咪定组大鼠于术后即刻开始至处死前1天，每天腹腔注射50 μg/kg右美托咪定，1次/d，其他两组大鼠给予等容量生理盐水腹腔注射。分别于术前1 d（T0）、术后3 d（T1）、术后 7 d（T2）和术后 14 d（T3）对造模大鼠热痛阈（TWL）和机械痛阈（MWT）进行测定，分别于 T1、T2和 T3时测定完TWL和MWT后，处死并取脊髓组织，利用实时荧光定量PCR检测大鼠脊髓背角中COX-2 mRNA和c-fos mRNA表达。结果与假手术组比较，神经病理性痛组和右美托咪定组大鼠T1～T3时TWL均缩短，MWT均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），与神经病理性痛组比较，右美托咪定组大鼠T1～T3时TWL均延长，而MWT均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与假手术组比较，神经病理性痛组和右美托咪定组大鼠T1～T3时COX-2 mRNA相对表达量和c-fos mRNA相对表达量均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），与神经病理性痛组相比，右美托咪定组大鼠T1～T3时COX-2 mRNA相对表达量和c-fos mRNA相对表达量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论右美托咪定可有效抑制神经病理性痛大鼠中枢痛觉敏化，其机制可能与下调脊髓背角COX-2和c-fos表达有关。

右美托咪定；神经病理性痛；大鼠；环氧化酶-2；c-fos

右美托咪定是一种美托咪定的右旋异构体，可高选择性激动α2肾上腺素能受体，在镇痛、镇静及抗交感神经活性等方面发挥重要作用[1]，有研究指出[2]，右美托咪定可有效缓解神经病理性疼痛。但具体作用机制尚未完全研究清楚。有研究指出[3]，外周神经发生损伤后，环氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）在脊髓背角中的表达上调，通过一系列细胞级联反应而使脊髓神经元敏化，引发并维持神经病理性疼痛。c-fos基因在细胞分化、繁殖、生长及信息传递等过程中发挥重要作用[4]，其在正常生理状态下在神经元细胞中呈极低表达水平，但当外界出现机械或物理性刺激时，会导致脊髓中c-fos大量表达，从而导致脊髓神经元可塑性变化，可能是引起中枢敏化的原因之一[5]。本研究拟探讨右美托咪定对神经病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表达的影响，分析其镇痛的可能机制，以期为临床实践提供理论基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

90只健康成年雄性Wistar大鼠，由河南省实验动物中心提供，体重185～220 g，7周龄，饲养于24℃室温条件下，相对湿度50%～60%，自由摄食和饮水。利用随机数字表随机分为假手术组（n=30）、神经病理性痛组（n=30）和右美托咪定组（n=30）。

1.2 模型复制及处理

按照文献[6]的步骤复制大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤模型：利用40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，将右后肢股骨中段皮肤切开，对肌肉进行分离，使坐骨神经暴露，利用4-0丝线在坐骨神经干上松扎4道，每道间隔1 mm左右，保证神经外膜稍微受压但又不让血管完全阻断，结扎过程可见大鼠肢体轻微发生抽动。操作完毕，用2 mg青霉素对切口进行外敷以防感染。假手术组大鼠仅对坐骨神经进行分离但不行结扎，右美托咪定组大鼠于术后即刻开始至处死前1天，每天腹腔注射50 μg/kg右美托咪定（批准文号：国药准字H20090248，生产单位：江苏恒瑞医药股份有限公司），1次/d，其他两组大鼠给予等容量生理盐水腹腔注射。

分别于术前 1 d（T0）、术后 3 d（T1）、术后 7 d（T2）和术后14 d（T3）对造模大鼠热痛阈（thermal pain threshold，TWL） 和 机 械 痛 阈 （mechanicalpain threshold，MWT）进行测定。利用XR1102热刺痛仪（购自上海欣软信息科技有限公司）对热痛阈进行测定，大鼠置于厚度为3 mm的玻璃板上，利用热辐光源对右后肢足底部进行照射，对从开始照射至出现缩足反应的时间进行记录，单次照射时间在20 s以内，连续进行3次，每次间隔5 min，求均值。利用von Frey纤维丝（购自美国Stoelting公司）对机械痛阈进行测定，将大鼠置于透明玻璃箱内，分别选取压力 为 （0.41、0.52、0.87、1.16、2.05、3.61、5.50、8.28、10.33和16.73 g）的von Frey纤维丝，利用初始刺激压力为2.05 g的纤维丝垂直缓慢地对大鼠右后肢足底部进行刺激，每次间隔＞30 s，以大鼠出现躲避、抬足或舔足反应为阳性，以纤维丝发生90°弯曲而无反应为阴性，采取序贯法[7]对MWT进行计算，并分别在阈值上下刺激5次，求均值。

1.3 实时荧光定量PCR检测

分别于T1、T2和T3时随机从各组选取10只大鼠，测定完TWL和MWT后，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，断头处死。快速取出L4～L6节段脊髓组织，放入已冷冻的冻存管内，再保存于液氮中以备检。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法对大鼠脊髓中COX-2 mRNA和c-fos mRNA表达水平进行检测，COX-2、c-fos及内参引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计及合成。COX-2引物：正向 5'-CTGTATCCCGCCCTGCTGGTG-3'，反向5'-ACTTGCGTTGATGGTGGCTGTCTT-3'；c-fos引物：正向5'-CGGGTTTCAACGCGGACTAC-3'，反向5'-G TTGGCACTAGAGACGGACAGA-3'。取脊髓背角组织放入研钵内进行迅速研磨，利用Trizol总RNA提取试剂盒（购自美国C&M biolabs公司）对组织中总RNA进行提取，并测定RNA纯度，取A260/A280在1.8～2.0的标本作为合格标本。分别取2 μl总RNA进行逆转录cDNA。利用美国ABI 7500型qRT-PCR仪（购自美国ABI公司）进行PCR扩增，扩增条件：95℃预变性 30 s，94℃ 10 s，74℃ 15 s，60℃ 15 s，连续进行35个循环。利用2-△△Ct法对COX-2 mRNA和c-fos mRNA在脊髓背角组织中的表达水平进行分析。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间和组内比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠建模后情况

3组大鼠建模后均未见切口感染。假手术组大鼠未见明显异常，神经病理性痛组和右美托咪定组大鼠右后肢足趾出现并拢，轻度外翻状，常表现悬空、抬足等异常行为。右美托咪定组大鼠在给药后有轻度嗜睡现象，但容易被唤醒，醒后仍然可站立。

2.2 3组大鼠TWL和MWT情况

T0时，3组大鼠TWL和MWT差异无统计学意义（P＞0.05）；与假手术组比较，神经病理性痛组和右美托咪定组大鼠T1～T3时TWL均缩短，MWT均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与神经病理性痛组比较，右美托咪定组大鼠T1～T3时TWL均延长，而MWT均升高；与T0时比较，神经病理性痛组和右美托咪定组T1～T3时TWL均缩短，MWT均降低，与T1时比较，神经病理性痛组和右美托咪定组T2～T3时TWL均缩短，MWT均降低，与T2时比较，神经病理性痛组和右美托咪定组T3时TWL均延长，MWT则升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 3组大鼠不同时点脊髓背角组织中COX-2 mRNA和c-fos mRNA相对表达量

与假手术组比较，神经病理性痛组和右美托咪定组大鼠T1～T3时COX-2 mRNA相对表达量和c-fos mRNA相对表达量均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与神经病理性痛组比较，右美托咪定组大鼠T1～T3时COX-2 mRNA相对表达量和c-fos mRNA相对表达量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与T1时比较，神经病理性痛组和右美托咪定组大鼠T2～T3时COX-2 mRNA相对表达量和c-fos mRNA相对表达量均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与T2时比较，神经病理性痛组和右美托咪定组大鼠T3时COX-2 mRNA相对表达和c-fos mRNA相对表达量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 3组大鼠不同时间TWL和MWT比较 （±s）

表1 3组大鼠不同时间TWL和MWT比较 （±s）

注：1）与假手术组比较，P ＜0.05；2）与神经病理性痛组比较，P ＜0.05；3）与同组内 T0时比较，P ＜0.05；4）与同组内 T1时比较，P ＜0.05；5）与同组内T2时比较，P＜0.05

指标组别T0（n=30）T1（n=30）T2（n=20）T3（n=10）TWL/s 假手术组（n=10） 16.7±1.1 15.7±1.0 15.3±0.9 16.2±1.2神经病理性痛组（n=10） 16.5±0.9 11.2±0.61）3） 9.1±0.51）3）4） 9.6±0.61）3）4）5）右美托咪定组（n=10） 16.0±1.1 12.3±0.51）2）3） 9.9±0.71）2）3）4） 11.2±0.41）2）3）4）5）F值 1.140 386.187 786.553 243.898 P值 0.324 0.000 0.000 0.000 MWT/g 假手术组（n=10） 19.5±1.2 20.3±1.5 19.9±1.3 21.1±1.7神经病理性痛组（n=10） 20.2±1.3 9.4±0.61）3） 7.2±0.41）3）4） 8.6±0.31）3）4）5）右美托咪定组（n=10） 19.9±1.4 12.6±0.81）2）3） 8.9±0.61）2）3）4） 10.1±0.51）2）3）4）5）F值 0.979 1 063.892 1 752.670 453.681 P值 0.380 0.000 0.000 0.000

表2 3组大鼠不同时间脊髓背角组织中COX-2 mRNA和c-fos mRNA相对表达量 （±s）

表2 3组大鼠不同时间脊髓背角组织中COX-2 mRNA和c-fos mRNA相对表达量 （±s）

指标 组别 T1 T2 T3 COX-2 mRNA 假手术组（n=10） 1.05±0.04 1.09±0.06 1.07±0.10神经病理性痛组（n=10） 3.61±0.141） 7.43±0.251）4） 5.38±0.201）4）右美托咪定组（n=10） 2.08±0.071）2） 5.52±0.131）2）4） 2.94±0.161）2）4）F值 2033.126 5256.238 1857.225 P值 0.000 0.000 0.000

续表2

3 讨论

神经病理性痛作为常见的慢性疼痛，患者常出现异常疼痛、痛觉过敏或感觉异常等症状，给患者生存质量带来严重影响[8]，本研究复制神经病理性痛大鼠模型，结果显示，神经病理性痛组和右美托咪定组大鼠右后肢足趾出现并拢，轻度外翻状，常表现悬空、抬足等异常行为，且与假手术组比较，神经病理性痛组和右美托咪定组大鼠T1～T3时TWL均缩短，MWT均降低，说明制备的神经病理性痛大鼠模型复制成功。

本研究结果显示，与假手术组比较，神经病理性痛组和右美托咪定组大鼠T1～T3时COX-2 mRNA相对表达量和c-fos mRNA相对表达量均升高，说明神经病理性痛发生与脊髓背角中COX-2和c-fos表达上调有关，且随时间表达变化情况与痛阈变化相一致，提示COX-2和c-fos参与神经病理性痛的发生及进展过程，分析原因，当外周神经发生损伤时，会特异性激活胞内型磷脂酶A2活性，激发脊髓磷脂酶-环氧化酶-前列腺素级联通路级联放大反应[9]，使COX-2表达升高、前列腺素物质释放增多，从而使谷氨酸等末梢神经兴奋物质释放增加[10]，进而激活脊髓背角神经元NMDA受体，导致Ca2+内流增加[11]，而神经元内增高的Ca2+又可促使cAMP生成，导致AMP反应元件结合蛋白磷酸化而被激活，进一步与cAMP反应元件结合而促使c-fos基因大量表达，产生的c-fos蛋白则可与c-jun蛋白结合形成复合物，通过激活目的基因而促使炎症因子合成及释放，从而引起痛觉过敏[12]。

本研究结果显示，在给予大鼠腹腔注射右美托咪定后，模型大鼠痛阈增高，神经病理性痛缓解，与神经病理性痛组比较，右美托咪定组大鼠T1～T3时COX-2 mRNA相对表达量和c-fos mRNA相对表达量均降低，提示右美托咪定可通过抑制脊髓背角组织中COX-2和c-fos的表达，而达到抑制神经病理性痛。分析原因，右美托咪定通过抑制COX-2表达及活性，减少前列腺素的产生，引起谷氨酸受体介导的兴奋性突触后电流减少，使突触前膜自发性释放谷氨酸降低[13]，同时，前列腺素水平的降低亦可使突触前膜电压依赖性Ca2+内流减少，加之右美托咪定本身可通过特异性激活α2肾上腺素能受体，对脊髓背角神经元Ca2+通道进行抑制[14]，从而降低胞内Ca2+水平，从而使cAMP合成减少，c-fos基因表达被抑制，炎症因子合成减少，从而抑制痛觉过敏的发生。

综上所述，右美托咪定可有效抑制神经病理性痛大鼠中枢痛觉敏化，其机制可能与下调COX-2和c-fos表达有关。

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（王荣兵 编辑）

Effect of Dexmedetomidine on spinal expression of COX-2 and c-fos in rat models of neuropathic pain*

Meng-ting Qin1,Zhong-peng Qiu2,Ye-zhong Wang1
(1.Department of Critical Medicine,2.Department of Orthopedics,First Affiliated Hospital of Shihezi University,Shihezi,Xingjiang 832008,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Dexmedetomidine on spinal expressions of cyclooxygenase-2 (COX-2)and c-fos in spinal dorsal horns of rat models of neuropathic pain.MethodsA total of 90 healthy adult male Wistar rats were randomly divided into sham group (n=30),neuropathic pain group(n=30)and Dexmedetomidine group(n=30).Rat models of neuropathic pain were established by sciatic nerve ligation.Sham operated rats

all procedure except for sciatic nerve ligation.Dexmedetomidine was intraperitoneally injected(50 μg/kg)daily in the Dexmedetomidine group.Vehicle saline were administered into the remaining animals.Thermal pain threshold (TWL)and mechanical pain threshold (MWT)were measured 1 day before operation(T0),and the 3th d(T1),7th d(T2)and 14th d(T3)after surgery,then spine were harvested immediately.COX-2 and c-fos in spinal cord dorsal horns were determined by real-time quantitative PCR.ResultsCompared with the sham group,TWL and MWT in the neuropathic pain group and Dexmedetomidine group decreased significantly at T1～T3(P＜ 0.05);TWL and MWT in the Dexmedetomidine group increased.at T1～T3(P＜ 0.05)compared with the neuropathic pain group.Expression levels of COX-2 mRNA and c-fos mRNA in the neuropathic pain group and the Dexmedetomidine group were increased at T1～T3dramatically (P＜ 0.05),but was alleviated by treatment of Dexmedetomidine compared between the neuropathic pain group and Dexmedetomidine group (P＜0.05).Conclusion Dexmedetomidine inhibits central neuropathic hyperalgesia in rat models of neuropathic pain,which may be related to down-regulation of COX-2 and c-fos.

Dexmedetomidine;neuropathic pain;cyclooxygenase-2;c-fos

R791.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.003

1005-8982（2017）27-0012-05

2017-05-30

国家自然科学基金（No：81360185）