单味中草药对仔猪致病性大肠杆菌体外抑菌试验

韩 雪

(1.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730030;2.清水乡畜牧兽医工作站,甘肃岷县 745400)

单味中草药对仔猪致病性大肠杆菌体外抑菌试验

韩 雪

(1.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730030;2.清水乡畜牧兽医工作站,甘肃岷县 745400)

为了筛选出对仔猪致病性大肠杆菌流行株体外抑菌活性强的单味中草药,本实验用水提法制备复方中草药药液,浓度为1g/mL;利用平板打孔法和试管二倍稀释法分别测定单味中草药抑菌圈直径大小和最小抑菌浓度(MIC)。

药物;大肠杆菌

猪腹泻是由具有特定血清型的大肠杆菌引起的。致病性大肠杆菌病因年龄的不同而表现出不同的差异，根据研究，这种差异与仔猪肠道黏膜上皮细胞的受体的表达水平有关，而这种差异的表现在猪发病日龄和发病特征上，例如 1 周龄以内的仔猪易患仔猪黄痢，10～30 日龄的猪易患仔猪白痢，在断奶前后的仔猪最易患水肿病。大肠杆菌引起猪腹泻的机理还与致病性大肠杆菌的存在有一个或更多的菌毛有关，是导致仔猪腹泻的一个前提条件就是菌毛与肠道内的受体结合，所以，我们把菌毛也叫做粘附素（adh esin）或定居因子（Colonization factor，CF），菌毛的生物学本质是蛋白质，是引起仔猪腹泻主要的致病机理。

中草药富含多种抑菌的化学活性物质，不仅对E.coli具有直接或者间接的杀灭作用，还可以清除内毒素和消除E.coli菌耐药质粒，降低其耐药性，在国内中草药防治鸡、猪源大肠杆菌病的研究相对较多，被广泛应用与猪源大肠杆菌病的防治中。

1 单味中草药药液的制备

用水提法提取中药的有效成分，将12味中药烘干，各取50g，加入5～10倍蒸馏水浸泡2h，煮开后慢火煮30min左右，12层纱布过滤，用同样方法再煮一次，过滤，合并2次煮的药液进行浓缩，浓度的浓度为1g/mL，离心后，调整pH值为7.2～7.3，121℃高压灭，15min，4℃保存备用。

2 大肠杆菌菌液的制备

取出仔猪致病性大肠杆菌的菌种，室温解冻后，接种于伊红美蓝培养基上，37℃恒温培养12h后，挑单菌落，接种于营养肉汤中，置于37℃摇床震荡培养12h，利用平板菌落计数法对该菌进行计数，调整仔猪致病性大肠杆菌终浓度为108CFU/ml。

3 单味中草药抑菌圈直径的测定与结果

利用平板打孔法测定中药水提物抑菌圈直径大小，取仔猪致病性大肠杆菌0.1ml（108CFU/ml）涂布在平板，在超净工作台中待完全吸收后，取无菌的牛津杯放在普通培养平板上，加满药液，静置0.5h后，置37℃培养12h，每一种药物做3个重复，取平均值；判定标准为：10mm＜抑菌直径为低敏，10mm≤抑菌直径＜15mm为中敏，15mm≤抑菌直径＜20mm为高敏，20mm≤抑菌直径为极敏。由表1可知，仔猪致病性大肠杆菌对金银花、黄连、诃子、五味子、苦参5味单味中药高度敏感，抑菌圈直径分别为在19.2mm、17.1mm、18.5mm、18.9mm、18.1mm；对板蓝根、白头翁、连翘、五倍子4种3种药物中度敏感，抑菌圈直径分别为14.7 mm、13.6 mm、15.4 mm、12.1 mm；对秦皮、蒲公英2种药物低敏，抑菌圈直径在分别为8.5mm、9.2mm；仔猪致病性大肠杆菌对败酱草无明显作用。

4 单味中草药体外抑菌MlC的测定与结果

利用试管二倍稀释法测定中药水提物的最小杀菌浓度（MBC）[8]，取12只编号的灭菌的试管，每个试管中加入无菌的营养肉汤2mL，在第1管中加2ml中药水提物混匀，取出2ml混合药液放入第2管，依此类推，稀释到第10管，弃去2ml，第11管为阳性对照，第12管为阴性对照。在1～11只管中加入菌液20µl（108CFU/ml），每一种药物3个重复，37℃培养18～24h后，将每个药物不同浓度的培养物接种于普通培养基上，37℃培养箱中培养12～18h。无细菌生长中药水提物浓度梯度为该药的MBC。由表2可知，仔猪致病性大肠杆菌对金银花、黄连、诃子、五味子、苦参5味单味中药高度敏感，体外抑菌MIC分别为7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、15.63 mg/ml、31.25 mg/ml；对板蓝根、白头翁、连翘、五倍子4种药物中度敏感，体外抑菌MIC分别为62.5 mg/ml、62.5 mg/ml、125 mg/ml、125 mg/ml；对秦皮、蒲公英2种药物低敏，体外抑菌MIC分别为分别为250mg/ml、250mg/ml仔猪致病性大肠杆菌对败酱草无明显作用。

5 小结

猪腹泻是由具有特定血清型的大肠杆菌引起的，感染不同阶段的仔猪，会引发同的症状，仔猪因年龄的不同而表现出不同的病候，1 周龄以内的仔猪易患仔猪黄痢，10～30 日龄的猪易患仔猪白痢，在断奶前后的仔猪最易患水肿病，这3种病均是由仔猪的致病性大肠杆菌引起的来，仔猪的致病性大肠杆菌发病率和感染率均较高，该菌易产生耐药性。本文利用平板打孔法和试管二倍稀释法分别测定单味中草药抑菌圈直径大小和最小抑菌浓度（MIC）。结果显示，筛选出来了对猪致病性大肠杆菌流行株高度敏感的5种种草哟，金银花、黄连、诃子、五味子、苦参；抑菌圈直径分别为19.2mm、17.1mm、18.5mm、18.9mm、18.1mm；体外抑菌MIC分别为7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、15.63 mg/ml、31.25 mg/ml；为进一步研制复方中草药防治仔猪致病性大肠杆菌病和临床应用提供理论基础。

表1 单味中草药对仔猪致病性E.coli抑菌圈直径结果（单位：mm）注“-”无敏感性

表2 单味中草药对仔猪致病性E.coli抑菌圈MlC结果（单位：mg/ml）注“-”无敏感性

[1]向双云，周珍辉，李玉冰，等.8种中草药对大肠杆菌的体外抑菌试验[J].黑龙江畜牧兽医，2016，（5下）：167-169.