三七总皂苷对人骨髓瘤细胞增殖与凋亡的影响

张倩倩，李晓红

(河北省中医院，石家庄050011)

三七总皂苷对人骨髓瘤细胞增殖与凋亡的影响

张倩倩，李晓红

(河北省中医院，石家庄050011)

目的探讨三七总皂苷对人骨髓瘤细胞U266增殖、凋亡的影响。方法将培养好的U266细胞随机分为空白对照组、阳性对照组及三七总皂苷低、中、高浓度组，分别加入无血清RPMI1640培养液、3.2 mmol/L的地西他滨及50、100、200 mg/L三七总皂苷各200 μL，继续培养24、48、72 h。采用MTT法测算细胞增殖抑制率，用流式细胞术检测凋亡细胞比例。采用简单线性回归分析浓度、时间依赖性。结果三七总皂苷组随干预时间延长、药物浓度增加，细胞增殖抑制率、凋亡细胞比例升高。干预72 h，三七总皂苷高浓度组细胞增殖抑制率、凋亡细胞比例高于空白对照组及三七总皂苷低、中浓度组(P均<0.05)，与阳性对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论三七总皂苷可抑制U266细胞增殖、促进其凋亡，且该作用具有时间浓度依赖性。

骨髓瘤；三七总皂苷；U266细胞；细胞增殖；细胞凋亡

多发性骨髓瘤是一种来源于浆细胞的恶性血液肿瘤，其发病率仅次于白血病，排在血液系统肿瘤的第2位。多发性骨髓瘤病情进展迅速，生存期约4年[1]。目前临床多采用激素联合化疗药物治疗多发性骨髓瘤，但多发性骨髓瘤异质性很强，瘤细胞可在骨髓中迅速增殖，导致骨折、骨髓功能衰竭。多发性骨髓瘤生长的速度与骨髓微环境密切相关。复杂的生长环境导致多发性骨髓瘤易形成耐药性，因此临床以个体化治疗为主[2]。三七又名田七，具有散瘀止血、消肿镇痛等功效[3]，其主要活性成分为三七总皂苷。三七总皂苷具有降低血脂、增强细胞膜稳定性、调节免疫力、清除自由基、抗炎、抗病毒、抗纤维化等作用。近年来还发现，三七总皂苷具有抗肿瘤作用[4]。有研究报道，三七总皂苷可抑制肝癌细胞(HepG2、H22、SMMC-7721)、白血病细胞(HL-60)、宫颈癌细胞(HeLa)和结肠癌细胞(SW480)在体外增殖，还可逆转肿瘤细胞多重耐药性[5]。2016年10月～2017年4月，本研究探讨不同浓度三七总皂苷对骨髓瘤细胞U266增殖的影响，为研究三七总皂苷的药理学功能提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源 三七总皂苷纯品购自昆明制药集团股份有限公司；人骨髓瘤细胞U266购自中国医学科学院天津血液病研究所；RPMI1640培养液购自美国Gene公司；Hyclone小牛血清购自美国Thermo scientific公司；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；地西他滨、四氮唑蓝(MTT)、台盼蓝购自美国Sigma-Aldrich公司；其余分析纯试剂购自国药集团北京分公司。

1.2 细胞分组及药物干预 将U266细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中培养后消化，置于96孔板，每孔1×104个。将细胞随机分为空白对照组、阳性对照组及三七总皂苷低、中、高浓度组，分别加入无血清RPMI1640培养液、3.2 mmol/L的地西他滨[6]及50、100、200 mg/L三七总皂苷各200 μL，每组设5个复孔。

1.3 U266细胞增殖能力检测 采用MTT法。将各组细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24、48、72 h，PBS清洗2次，加入5 mg/mL的MTT 20 μL继续培养4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，在摇床上放置15 min。酶标仪检测波长490 nm处光密度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(空白对照组A值-实验组A值)/空白对照组A值×100%。

1.4 U266细胞凋亡比例检测 采用流式细胞术。将各组细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24、48、72 h，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，PBS清洗2次，加入Binding buffer液500 μL重悬细胞，制备单细胞悬液并调整为1×106/mL，取细胞悬液200 μL，加入Annexin V-FITC流式抗体5 μL混匀，再加入Propidium Iodide 5 μL混匀，避光室温孵育20 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡比例。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 三七总皂苷组随药物干预时间延长、药物浓度增加，细胞增殖抑制率升高。干预24 h，阳性对照组细胞增殖抑制率高于其他组(P均<0.05)，空白对照组与三七总皂苷各浓度组比较差异无统计学意义(P均>0.05)；干预48 h，阳性对照组、高浓度三七总皂苷组细胞增殖抑制率高于其他组(P均<0.05)；干预72 h，三七总皂苷高浓度组细胞增殖抑制率高于空白对照组及三七总皂苷低、中浓度组(P均<0.05)，与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率比较

2.2 各组细胞凋亡比例比较 三七总皂苷组随药物干预时间延长、药物浓度增加，凋亡细胞比例升高。干预24、48、72 h，三七总皂苷高浓度组凋亡细胞比例高于空白对照组及三七总皂苷低、中浓度组(P均<0.05)，与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组凋亡细胞比例比较

3 讨论

多发性骨髓瘤是来源于分化阶段B细胞的血液肿瘤，发病后的中位生存期约为3年，仅有1/4患者生存期5年以上[7]。目前，地西他滨作为胞苷类似物广泛应用于治疗多发性骨髓瘤，其在低剂量时可通过去甲基化的方式抑制肿瘤相关基因活化，而这些基因参与调控肿瘤细胞周期，使得肿瘤细胞停滞于G0/G1期，同时还影响肿瘤细胞的黏附、凋亡、增殖、迁移等功能；高剂量时可直接杀伤肿瘤细胞[8]。但长期应用地西他滨可能导致中性粒细胞减少症和血小板减少症，使得多发性骨髓瘤患者出血倾向加重。因此需要寻找更为安全有效的药物治疗多发性骨髓瘤。

中医将多发性骨髓瘤归于“骨蚀”范畴，认为该病为“虚邪之入于身也深，寒与热相互搏”所致[9]。根据中医辨证施治的思想，我们对多发性骨髓瘤实施化疗的同时采用补肾化浊法治疗，取得满意效果。所用药物包括全虫、地龙、蜈蚣、三七、党参等多味中药，具有清解邪毒、健脾益气、化痰祛瘀的功效。三七在治疗肿瘤方面有独特功效，其为五加科人参属植物，以干燥根及根茎入药，味甘，微苦，性温，归肝、胃经，有散瘀止血、消肿止痛的功能。现代中药药理学研究已经证实，三七的活性提取物三七总皂苷能够抑制不同组织来源的人源性肿瘤细胞生长，而且在动物体内也发现三七总皂苷能够抑制移植瘤的生长，并且不良反应小，对肝、肾、骨髓等多种器官均无明显损伤[5,10,11]。三七总皂甙具有逆转肿瘤细胞多药耐药的效应，主要通过调控肿瘤细胞周期发挥对人肝癌细胞株SMMC-7721、胃细胞株MKN-28和人结肠癌细胞SW480的抑制作用。其药理学机制与抑制NF-κB蛋白活性，干预NF-κB通路有关。

多发性骨髓瘤是一种浆细胞恶性增殖性疾病，由于浆细胞在骨髓内大量增殖，造成溶骨性破坏和凝血功能障碍，临床可表现为骨痛、自发性骨折、感染、贫血、出血及高黏滞综合征、急慢性肾衰竭等。根据中国医师协会血液科医师分会制定的《2011年中国多发性骨髓瘤诊治指南》治疗方案，多发性骨髓瘤的治疗以抑制骨髓瘤细胞生存、阻止肿瘤生长和抑制血管生成为主，选用的药品包括沙利度胺、雷利度胺、硼替佐米和地西他滨等；而对于辅助化疗则主张选用不同靶点的药物抑制肿瘤细胞增殖，降低肿瘤的抗药性。三七总皂苷可以有效抑制细胞增殖的调控蛋白NF-κB表达，有效抑制骨髓瘤细胞增殖。这一点与地西他滨相似，可使得S期和G2～M期细胞比例明显降低，G0～G1期细胞比例明显增加。本研究结果显示，高浓度的三七总皂苷作用效果可以到达甚至超过地西他滨对多发性骨髓瘤的抑制作用；浓度为200 mg/L的三七总皂苷干预48、72 h后，U266细胞的凋亡比例明显增加。这说明大量的肿瘤细胞仍然处于G0/G1期，并未进一步增殖。

综上所述，多发性骨髓瘤作为一种恶性的血液系统肿瘤一直是临床治疗的难点之一，三七总皂苷可有效抑制多发性骨髓瘤细胞增殖，促进其凋亡。由于三七总皂苷不良反应少，对肝、肾、骨髓等多种器官均无明显损伤，具有潜在临床应用价值。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.009

R329.2

A

1002-266X(2017)37-0029-03

河北省中医药管理局科研计划(2011083)。

李晓红(E-mail:hblxh2002@163.com)

2017-07-18)