猪瘟防控净化技术研究

王琴/中国兽医药品监察所OIE猪瘟参考实验室

猪瘟防控净化技术研究

王琴/中国兽医药品监察所OIE猪瘟参考实验室

一、猪瘟流行病学研究进展

（一）猪瘟在国际上的流行情况

目前已宣布无猪瘟的有以下国家和地区：

澳大利亚 法国 墨西哥 斯洛伐克奥地利 德国 新喀里多尼亚 斯洛文尼亚比利时 新西兰 西班牙 加拿大爱尔兰 挪威 瑞典 智利意大利 巴拉圭 瑞士 捷克共和国日本 波兰 荷兰 丹麦列支敦士登 葡萄牙 英国 芬兰卢森堡 罗马尼亚 美国 巴西部分区域哥伦比亚部分区域

（二）我国政府高度重视猪瘟净化

根据《国家中长期动物疫病防治规则（2012-2020）》和《全国兽医事业发展“十二五”规则》确定的动物疫病防治总体目标与任务，猪瘟作为我国优先防治和重点防范的16种动物疫病之一，应对我国猪瘟的净化和防控提出指导性意见和具体的净化策略。明确提出了以下两点：猪瘟在2015年部分区域达到净化标准，原种猪场达到净化标准；2020年进一步扩大净化区域，全国所有种猪场达到净化标准。

二、猪瘟分子流行病学研究进展

（一）研究概况

历时37年，采集了1979-2016年的猪瘟研究数据，这些数据遍布中国大陆的31个省自治区，将近覆盖了98%的国土面积，收集到中国大陆868条数据信息（包括中国台湾省）。优化并且标准化欧盟猪瘟病毒E2基因RT-nPCR方法扩增猪瘟病毒E2基因主要区域的271bp的片段（与军事兽医研究所涂长春教授合作）。

（二）C株疫苗的研究

通过C株疫苗对我国猪瘟流行毒株的免疫保护试验数据来看，我国猪瘟流行毒株与疫苗株的同源性都在81.7%以上。

采用RID、7500RID、0RID三个免疫剂量免疫，根据结果可以看到疫苗的免疫期能持续578 d，在375d采用致死剂量的石门攻毒，可以做到完全保护。

（三）C株疫苗的研究意义

1.对阐明猪瘟病毒的遗传变异特征和分布规律、疫情追溯、揭示病毒的遗传进化背景具有十分重要的科学意义。

2.结合动物试验监测现行使用疫苗的有效性，提出新的防治策略也具有重要作用。

3.发现中国猪瘟病毒流行株基因组稳定，并证明现用猪瘟疫苗对我国流行毒株能有效保护，否定了多年认为“由野毒株变异引起免疫失败”的学术争端，一旦监测到野毒株低于77.2%，立即进行动物实验验证。

4.C株疫苗能抵抗全世界流行的三个基因型野毒的攻击。

5.C株疫苗不仅为世界上一些国家消灭猪瘟作出了贡献，至今对我国猪瘟控制的基本策略也是有效的。

6.对建立和丰富我国猪瘟流行病学数据库也具有十分重要的现实意义。因此，实施连续的不间断的我国猪瘟分子流行病学监测工作是猪瘟控制的重要手段，对于制定有效防控措施具有重要的指导意义。

（四）中国猪瘟控制成效

近年来，按照国家总体部署，坚持预防为主，实施免疫与扑杀相结合的综合防治措施，全国猪瘟疫情得到有效控制，疫情报告起数明显下降，流行态势日趋平稳，感染率较低，防控工作取得显著成效。

据监测，2015年全国猪场个体感染率0.15%；OIE国家猪瘟参考实验室今年对中国重点检测区域没有监测到阳性疾病。

（五）中国猪瘟控制的新目标和任务

2016年7月，农业部财政部联合印发了《关于调整完善动物疫病防控支持政策的通知》，自2017年起从中央层面退出对猪瘟的财政补助。

2017年3月，农业部印发《国家猪瘟防治指导意见（2017-2020年）》，标志着正式将猪瘟免疫净化付诸行动，这是我国猪瘟防控政策历史性的重大转变。

三、猪瘟诊断技术研究进展

1.猪瘟病原学诊断方法的原则

（1）诊断方法必须达到特异、敏感、快速、重复性好、结果易判定的标准；（2）早期确诊，避免传播风险；（3）持续感染呈现的非典型临床表现和病理变化，需要灵敏的检测方法；（4）全面的疫苗防控政策，需要鉴别感染猪与免疫猪；（5）与其他猪病的混合感染，也需要建立鉴别诊断技术。综上所述就是必须依照实验室诊断方法，提升诊断水平。

2.猪瘟病原学诊断方法

（1）经典的猪瘟病原学诊断方法：动物接种试验（很少使用）、病毒分离技术、荧光抗体检测技术（FAT）/免疫过氧化物酶检测技术（IPT）、抗原捕获-ELISA；

（2）分子诊断技术：PT-PCR技术（诊断和基因分型）、荧光定量RT-PCR技术（欧盟猪瘟参考实验室诊断标准）、恒温扩增技术（NASBA，LAMP）；

（3）病毒中和实验：体外病毒中和实验（VNT）、荧光抗体病毒中和实验（NIF）（国际贸易指定试验）、过氧化物酶联中和试验（NPLA）（国际贸易指定试验）、体内病毒中和试验、猪瘟病毒兔体中和试验、猪瘟病毒猪体中和试验；

（4）酶联免疫吸附试验（ELISA）：猪瘟病毒简介ELISA抗体检测方法（国际贸易指定试验，是我国第一个获得新兽药证书的猪瘟病毒ELISA抗体诊断试剂盒）、猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法（国际贸易指定试验）、猪瘟病毒化学发光抗体检测技术（ELISA）；

（5）其他常规诊断方法：猪瘟间接血凝试验（IHA）、免疫芯片技术。

3.猪瘟病毒化学发光抗体检测试剂盒

（1）化学发光酶免疫分析技术（CLIA）。CLIA是一种集灵敏的化学发光分析和特异的抗原抗体免疫测定技术于一体的检测技术，具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速、安全稳定和自动化程度高等优点。中国兽药监察所OIE猪瘟参考实验室与莱普生合作，经过2年的研究，采用一步竞争法建立了猪瘟病毒化学发光抗体检测试剂盒。以真核表达的E2蛋白作为包被物包被聚苯乙烯发光板（抗原包被板），加待检血清和E2蛋白单克隆抗体酶结合物后反应30min，经洗涤后加入发光底物，读取发光值，回算出猪瘟抗体计量值，从而反应出猪血清中猪瘟抗体含量，判断阴阳性结果。因此，待检血清中猪瘟抗体的浓度与发光值成反比。

（2）灵敏性实验。猪瘟病毒化学发光抗体检测试剂盒对200份猪瘟抗体阳性血清进行检测，同时用I-ELISA和B-ELISA试剂盒进行平行实验，化学发光抗体检测试剂盒的敏感性平均为95.8%，比I-ELISA和B-ELISA高出3～5个百分点。

（3）优势。猪瘟病毒化学发光抗体检测试剂盒是继传统ELISA技术之后发展起来的一项最新免疫测定技术，其优势体现为进一步优化了显色系统，用发光底物代替了传统的TMB底物，提高了检测的敏感性、特异性和稳定性，预测会取代传统ELISA。该试剂盒的优势有：①标记分子小，标记物非常稳定；②发光时间长，灵敏度高；③光信号线良好，动力学范围宽，超过6个数量级；④重现性好；⑤通过校准设置，使试剂盒的检测结果实现了相对定量；⑥实现了全自动化；⑦方便快速。由于本试剂盒采用一步竞争法，血清无需稀释，使工作更加简便快速，检测时间大大缩短。

4.猪瘟免疫失败原因分析

猪瘟依然在我国散发存在，造成免疫失败的原因主要有以下几方面。

（1）猪瘟持续感染带毒猪。

（2）个别猪体免疫功能异常。

（3）母源抗体对疫苗免疫的影响。

（4）免疫程序不科学。

（5）部分厂家猪瘟疫苗质量。

（6）疫苗运输的冷链系统不完善。

（7）多种病混合存在。

（8）诊断方法不特异。

四、我国猪瘟净化存在的挑战

（一）猪瘟防治思路

1.以预防为主的防控方针。

2.以源头控制、分类指导、梯度推进为防治原则—种群净化。

3.以养殖场（户）为防治主体。

4.以疫病净化为防治重点，不断完善养殖场生物安全体系。

5.严格落实免疫预防、监测净化、检疫监管、应急处理、无害化处理等综合防控措施。

6.积极开展场群或区域净化工作，降低发病率，压缩流行范围，有效清除病原，逐步实现净化。

7.加强区域管理，建设无猪瘟区和无猪瘟生物安全隔离区（无猪瘟企业）。

8.评估验收流程：示范场—县级主管部门—地级主管部门—省级主管部门—国家疫控中心。

（二）我国猪瘟保障措施

1.加强组织领导，地方各级人民政府对辖区内猪瘟防治工作负总责。

2.强化技术支撑，要依靠地方各级动物疫病预防控制机构，猪瘟实验室的技术力量，发挥专家委员会作用，分析流行动态，加强技术指导，提出政策措施建议，为防治工作提供技术支撑。

3.各级畜牧兽医部门要与猪瘟实验室密切配合，积极开展监测和流行病学调查工作，发展病原学阳性样品应及时送猪瘟实验室进行分析鉴定，及时掌握病原变异情况。

4.中国兽药监察所要加强猪瘟疫苗和诊断制品质量监管以及疫苗免疫效果评估。猪瘟实验室要及时借鉴国际疫情监测及预警先进经验，建立完善猪瘟疫情监测预警模型和数据库，持续跟踪病原遗传演化规律、病原分布、疫情动态，分析疫苗毒株与流行毒株的匹配性，监测疫苗的临床免疫效果，加强新型疫苗和诊断试剂等技术研究，提出防控对策建议。

5.强化政策保障。

6.落实经费保障。

7.加强宣传和国际合作。

（三）我国猪瘟净化技术支撑

1.技术支撑。快速敏感的诊断技术已经达到国际技术标准，并被国际上认可，为净化提供了技术支持。

2.理论基础。通过对猪瘟分子流行病学的研究，病毒基因组稳定，变异频率低，只有一个血清型，对该病毒的清除是一个有利的条件。

3.疫情预警。建立完善猪瘟疫情监测预警模型和数据库，持续跟踪病原遗传演化规律、病原分布，疫情动态，分析疫苗毒株与流行毒株的匹配性，监测疫苗的临床免疫效果。

4.技术保障。猪瘟疫苗依然是最优秀的疫苗，为猪瘟的控制提供了技术保障。

5.标记疫苗。是我国猪瘟疫苗的急需产品。

根据以上技术支持，建立了猪瘟综合防控净化模式，中国猪瘟净化，将不再只是一句空谈，是切实可以实现的。