口腔鳞癌患者与健康人唾液差异蛋白组学的初步研究

孙昆俊 马洪 康颖倩 邹贤玉

口腔鳞癌患者与健康人唾液差异蛋白组学的初步研究

孙昆俊 马洪 康颖倩 邹贤玉

目的研究口腔鳞癌患者与健康人唾液蛋白差异表达情况。方法收集口腔鳞癌患者唾液17 例，健康人唾液17 例，通过以双向凝胶电泳技术以及质谱鉴定和生物信息学分析，寻找在口腔鳞癌患者唾液中差异表达的蛋白质。结果选取口腔鳞癌患者和正常人唾液中具有明显差异表达的10 个蛋白质点，进行质谱鉴定和生物信息学分析，共鉴定出3 种差异表达的蛋白质，其分别为 S100A8、S100A8/ S100A9及表皮角蛋白2(EK2)在口腔鳞癌患者唾液中均呈高表达。结论S100A8、S100A8/ S100A9及EK2可能与口腔鳞癌患者发生有关。

唾液； 口腔鳞癌； 蛋白质组学； 双向电泳(2-DE)； 肿瘤标志物

长期以来，寻找早期诊断的恶性肿瘤标志物(tumor marker，TM)已成为了人们关注的焦点[1]。恶性肿瘤是一种涉及多种分子事件的疾病，其生长过程中由于基因突变、异常转录、和翻译，必然会导致不同程度的蛋白质表达和修饰异常，而蛋白质组学的兴起则为了解肿瘤蛋白质之间的相互作用与联系，从而揭示生物学行为以及基因表达调控机制提供了一个新的研究领域，并且目前发掘肿瘤标志物的强力工具正是蛋白组学方法和技术[2]。其还具备分析不同蛋白质组之间蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异，研究差异蛋白质及其功能[3]。

本研究采用双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)技术分离口腔鳞癌患者和健康人的唾液蛋白，比较口腔鳞癌患者和健康人差异表达明显的蛋白点，再应用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-time of flight,MALDI-TOF/MS)以及生物信息学分析，寻找在口腔鳞癌患者唾液中特异蛋白质的变化，鉴定出这些差异表达的蛋白质种类和性质，以期发现在口腔鳞癌的早期诊断和治疗上存在潜在的价值的肿瘤标志物，并为口腔鳞癌的发生发展机制研究提供初步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究标本 标本来源于贵阳医学院附属医院口腔颌面外科，未采用任何针对肿瘤的治疗如手术、放疗、化疗等，且经病理证实口腔鳞癌患者唾液17 例，健康人唾液17 例。口腔鳞癌唾液标本来源情况：男性14 例，女性3 例，年龄范围55～68 岁，平均年龄55.8 岁。 其中高分化鳞癌10 例，中分化鳞癌6 例，低分化鳞癌1 例。健康人唾液标本来源情况：贵阳医学院2010 级口腔颌面外科研究生及患者家属，体检均健康，既往无肿瘤史。

1.1.2 主要试剂 IPG Buffer和IPG胶条(13 cm，线性，pH 3～10)(GE Healthcare公司，美国)；广谱蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail Set I 10VL,AppliChem公司，德国)和BCA定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit 500 assa,北京康为世纪生物科技有限公司)；2D-clean up试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech公司，美国)；考马斯G-250染料(Sigma公司，德国)等。

1.1.3 实验仪器 紫外-可见光分光光度计(UV-1700PC型，上海奥析科学仪器有限公司)，超低温冷冻离心机(Fresco 21型，Thermo Scientific公司，美国)；Image Scanner扫描仪、Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪、EPS601垂直电泳仪、Image Master 2D Platinum 6.0图像分析软件(Amersham Biosciences公司，美国)等。

1.2 实验方法

1.2.1 标本处理 所有研究标本采集均为清晨空腹漱口后15 min，并且口腔鳞癌患者唾液在术前采集，收集量一般为4～5 ml，经4 000 r/min离心5 min后置于-80 ℃保存。

1.2.2 蛋白质样本制备 取-80 ℃保存的患者唾液和正常对照唾液，室温溶解后按丙酮沉淀法提取离心管底部白色绵絮状物质，再按照2-D Clean up Kit试剂盒说明书操作进行蛋白纯化及去除高峰度蛋白。

按照Bradford[4]法测定蛋白浓度。

双向凝胶电泳(2-DE)分离蛋白。双向凝胶电泳(2-DE)所用仪器：Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪、Electrophoresis Power Supply-EPS601垂直电泳仪、Image Master 2D Platinum 6.0图像分析软件(Amersham Biosciences公司，美国)。

1.3 凝胶图像分析

染色后凝胶由Image Scaner采集图像，运用Image Master 2D Platinum 6.0软件进行图像分析，按照Corbett[5]方法筛选差异蛋白斑点。

MALDI-TOF/MS(中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研究分析中心)质谱分析及数据检索。

2 结 果

2.1 双向电泳结果

选取在鳞癌患者和健康人唾液中差异表达明显的10 个蛋白点进行质谱鉴定。结果如图 1所示(均为考马斯亮蓝R250染色)。

图 1 唾液蛋白2-DE图谱

2.2 候选蛋白的MALDI-TOF/MS质谱分析联合数据库检索结果

10 个蛋白标本经过质谱鉴定和数据库检索后，得分均超过50 分。10 个差异蛋白点质谱鉴定和数据库查询结果见表 1。

3号样品经过氨基酸覆盖率及经过二级质谱(MS/MS)鉴定为钙结合蛋白(Calprotectin)，综合得分为332;6号样品鉴定为钙结合蛋白同型蛋白(Calprotectin)，综合得分为410；8号样品经过氨基酸覆盖率及经过二级质谱(MS/MS)鉴定为表皮角蛋白2( Epidermal cytokeratin 2)，综合得分为153。

3 讨 论

口腔肿瘤蛋白质组学研究一方面建立口腔肿瘤的全蛋白表达谱，可以用于肿瘤的分离鉴定；另一方面研究肿瘤与正常细胞的差异表达，筛选出各种病损的特异蛋白，构建肿瘤发生发展的蛋白组谱和分子机制，发现与评估组织、血清、唾液中的特异蛋白作为生物标记，国外已有学者运用于头颈鳞癌临床无创伤早期诊断、分级和预后的初步研究[6-7]。但由于口腔鳞癌患者的唾液蛋白研究缺乏理想的模式，近几年来对于唾液蛋白在口腔鳞癌的发病机制的研究尚未获得突破性的进展，因此寻求更为前沿的技术，在客观上利于对口腔鳞癌的病因学机理、诊断及预后评估等进行研究。因此，通过蛋白组学鉴定口腔鳞癌患者与健康人唾液中蛋白的方法在筛选不同侵袭能力细胞系之间差异蛋白质方面具有应用价值[8-9]。

表 1 10 个差异蛋白点质谱分析和数据库查询结果

注： ↑: 与健康人相比蛋白表达量升高，↓: 表达降低

本实验初步鉴定出在口腔鳞癌患者唾液中呈高表达的3 个蛋白点(3、6、8号)分别是S100A8/ S100A9、S100A8、表皮角蛋白2。类似工作国内尚未见有关文献报道。

S100A8/S100A9和S100A8在S100蛋白家族中又分别被称为MRP8、MRP14，由于骨髓和上皮细胞中的S100A8和S100A9能通过肿瘤分泌的可溶性因子VEGF-A、肿瘤生长因子b(tumor growth factor b，TGFb)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)被诱导表达， 因此其被认为是与肿瘤的发生、发展最紧密相关的因子[10]。两者均可作为中性粒细胞强有力的诱导剂起到化学趋化性和黏附性作用，并且除了在炎症反应过程中展现关键作用外，还具备抑制生长、促使细胞凋亡的功能，包括促使肿瘤细胞的凋亡[11]。因此，S100A8、S100A9蛋白在急、慢性炎症反应中存在差异表达，可作为中性粒细胞抗肿瘤的效应器分子中的一员。并且S100A8及S100A8/A9在细胞外不仅参与调节细胞内钙及信号转导，同时也作为机体内多种生物学功能的调和剂之一，对细胞骨架结构、细胞形态变化产生影响[12]。本课题组[13]前期通过研究口腔鳞癌患者和健康人的组织蛋白差异表达，发现口腔鳞癌组织中S100A8和S100A9显著表达，健康人组织中无表达。Hu等[14]也通过2-DE和LC-MS/MS技术，鉴定出口腔鳞癌患者唾液中S100A9蛋白过表达，而正常人唾液中未发现S100A9表达。

表皮角蛋白2(epidermal cytokeratin 2,EK2)是由一类后期表皮细胞骨架蛋白在后期分化过程中合成的II型细胞角蛋白，主要存在于鳞状上皮、肌上皮、外分泌腺导管上皮等细胞中，而在肿瘤组织中呈特异表达，并随分化程度、细胞生长环境或病理的改变而发生变化。然而表皮角蛋白除了具备相应的生理功能外，还参与了细胞增殖调控、细胞特异性的细胞器运输、恶性转化及各种应激反应，而且其参与恶性转化的能力已有相关研究指出，恶变的鳞状上皮具有大分子角蛋白(Ⅰ型)含量减少、小分子角蛋白(Ⅱ型)增多及小分子与大分子角蛋白共存2 大特征。后期国外学者研究发现[15]通过2-DE和MALDI-TOF/MS技术，比较头颈部癌患者血清与正常人血清差异蛋白表达时，其中筛选出EK2在病理血清中呈上调表达。由此证明癌细胞的分化与功能都会影响到EK 的表达，以此来推测癌细胞的功能状态是可能的。

本实验采用双向凝胶电泳技术结合MALDI-TOF/MS质谱鉴定技术先后对口腔鳞癌唾液凝胶差异表达明显的10个蛋白点进行质谱鉴定，结果提示S100A8/ S100A9、S100A8及EK2在口腔鳞癌患者唾液中均呈高表达，但其具体机制有待进一步研究。

(致谢: 本研究中MALDI-TOF/MS质谱分析由中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研究分析中心完成)

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Aprimarystudyofthedifferentialproteomicexpressioninsalivaofhealthpeopleandthepatientswithoralsquamouscellcarcinoma

SUNKunjun,MAHong,KANGYingqian,ZOUXianyu.

1. 550004Guiyang,DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,FacultyofStomatology,GuiyangMedicalUniversity,China; 2.KeyLaboratoryofProteomicsofGuiyangMedicalUniversity,Guiyang

Objective： To study the differentially expressed proteins in saliva of health people and the patients with oral squamous cell carcinoma(OSCC).MethodsSaliva of 17 cases with OSCC and paired health subjects was collected, the proteins in the saliva were examined by two-dimensional gel electrophoresis(2-DE) separation, the proteins were examined by 2-DE separation, the saliva proteome dimensional electrophoresis profiles were obtained by MALDI-TOF/MS mass spectrometric identification, the information of the differentially expressed protein in OSCC group was studied by NCBI database bioinformatics analysis.Results10 proteins differentially expressed between the 2 groups were observed by mass spectrometry. Bioinformatics analysis showed that S100A8,S100A8/S100A9 and Epidermal cytokeratin 2(EK2) were highly expressed in the saliva of OSCC cases.ConclusionS100A8,S100A8/S100A9 and EK2 may be related to the development of OSCC．

Saliva;OralSquamouscellcarcinoma(OSCC);Proteomics;Two-dimensionalgelelectrophoresis(2-DE);Tumormarker

2007年贵州省优秀人才省长基金[编号： 黔省专合字(2006)116号]

550004， 贵州医科大学口腔医学院口腔颌面外科学教研室(孙昆俊 马洪 邹贤玉)； 贵州医科大学蛋白组学重点实验室(康颖倩)

马洪 0851-86773514 E-mail: mahong1966@126.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.017

(收稿： 2017-01-28 修回： 2017-03-24)