高压氧预适应对高原缺氧大鼠血脑屏障的保护作用

周虎传，吴丽华，郝 磊，邹 璨，唐晓红，刘 磊

中国人民解放军第324医院脑血管病中心，重庆 400020

·短篇论著·

高压氧预适应对高原缺氧大鼠血脑屏障的保护作用

周虎传，吴丽华，郝 磊，邹 璨，唐晓红，刘 磊*

中国人民解放军第324医院脑血管病中心，重庆 400020

目的探讨高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)预处理对高原缺氧大鼠血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的保护作用。方法SD大鼠随机分为正常对照组、高原缺氧组、HBO预处理高原缺氧组，经尾静脉注射2%伊文思蓝(Evans blue，EB)，采用荧光显微镜观察脑组织EB光斑、紫外分光光度计检测脑组织EB含量、干湿重法测定脑组织含水量来评定BBB通透性的变化。结果正常对照组大鼠脑组织红色光斑数、EB含量、脑组织含水量低于高原缺氧组和HBO预处理高原缺氧组，差异有统计学意义(P<0.001)；高原缺氧组大鼠脑组织红色光斑数、EB含量、脑组织含水量高于HBO预处理高原缺氧组，差异有统计学意义(P<0.001)。结论HBO预处理能明显降低高原缺氧所致的大鼠BBB通透性增加，对高原缺氧导致BBB损伤具有保护作用。

高压氧预处理；血脑屏障；高原缺氧

高原脑水肿是指从低海拔的平原快速进入高海拔的高原时，脑组织急性缺氧引起的中枢神经系统功能严重障碍[1]。研究[1-3]证实低氧预适应可降低血脑屏障的通透性，减轻脑梗死体积。但低氧预适应有其局限性，不能应用于临床。有研究[4]报道，高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)预处理能明显改善短暂性大脑中动脉堵塞所致大鼠神经功能缺损症状，减少梗死体积，降低出血转化，用于人类临床疾病的防治具有广阔的应用前景。但目前缺乏高压氧预处理对高原缺氧性血脑屏障损伤影响的相关研究。因此，本研究采用HBO预处理SD大鼠，然后迅速将HBO预处理后大鼠放入模拟海拔5 000 m高原的低压缺氧环境中，通过测定脑组织红色光斑数、伊文思蓝(Evans blue, EB)含量、脑组织含水量，以明确HBO预处理对高原缺氧性血脑屏障损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试药 雌性SD大鼠90只(陆军军医大学大坪医院动物室购买)，体质量200～250 g，随机均分为3组：正常对照组、高原缺氧组、HBO预处理高原缺氧组，每组30只。高压氧舱为烟台冰轮氧舱厂生产。2%EB购自Gibco公司，进口分装。

1.2 HBO预处理 将HBO预处理高原缺氧组30只SD大鼠放入动物用高压氧舱，以5 L/min氧流量洗舱10 min，使舱内氧浓度>98%，然后在15 min内匀速升压(氧流量约10 L/min)至2.5 atm(1 atm=101 325 Pa)，稳压吸氧1 h后，20 min匀速降压至常压。每天高压氧处理1次，连续处理5 d。

1.3 高原缺氧处理 将高原缺氧组和HBO预处理高原缺氧组大鼠放入FLYDWC50-ⅡA型低压低氧动物实验舱(中航工业贵州风雷航空军械有限责任公司生产，陆军军医大学高原医学系提供)，然后以10 m/s的速度减压，模拟上升至海拔5 000 m，维持24 h后以20 m/s的速度缓慢降至正常海拔高度。

1.4 制作EB标准曲线 用二甲基甲酰胺配制EB标准溶液，浓度分别为0.75、1.5、2.5、3.25、4.5、6.5 μg/mL，用UV1902PC紫外分光光度计测定各浓度溶液在波长620 nm的光密度(D620)值，将溶液浓度和所得光密度值进行线性回归处理，得出标准曲线方程。

1.5 脑组织EB含量的测定 将高原缺氧处理后的高原缺氧组、HBO预处理高原缺氧组和未处理的正常对照组每组分出10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉；然后经尾静脉注射2%EB(0.3 mL/100 g)，1 h后从左心室灌注0.9%氯化钠溶液，直至清亮液体从右心耳流出。断头取脑，去掉硬脑膜、软脑膜，称质量，捣碎脑组织放入50 mL离心管中，加入10 mL二甲基甲酰胺，放入50℃水浴箱孵育60 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液，应用UV1902PC紫外分光光度计检测波长620 nm处光密度(D620) 值。

1.6 脑组织含水量的测定 将高原缺氧处理后的高原缺氧组、HBO预处理高原缺氧组和未处理的正常对照组每组分出10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉；从左心室灌注0.9%氯化钠溶液，直至清亮液体从右心耳流出。断头取脑，用滤纸将脑表面水分吸干，在电子秤称湿质量，然后将脑组织放入110℃电子恒温烘箱烘烤48 h，然后称取干质量。脑组织含水量通过公式计算：脑组织含水量(%)=(湿质量-干质量)÷湿质量×100%。

1.7 荧光显微镜观察红色光斑 将3组大鼠每组分出10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉；然后经尾静脉注射2%EB(0.3 mL/100 g)，1 h后从左心室灌注0.9%氯化钠溶液，直到清亮液体从右心耳流出。再从左心室灌注4%多聚甲醛150 mL。断头取脑，去掉硬脑膜、软脑膜，将脑组织放入4%多聚甲醛浸泡72 h，再放入30%蔗糖溶液脱水24 h。然后行冰冻切片，片厚10 μm，荧光显微镜(Olympus BX51)在CY3激发状态下观察EB荧光光斑，每张切片选10个高倍镜视野计算光斑数。

2 结 果

2.1 脑组织EB含量的比较 正常对照组、高原缺氧组、HBO预处理高原缺氧组脑组织内EB含量分别为(3.40±0.26)、(43.47±4.27)、(28.49±1.13) μg/g。与对照组相比，高原缺氧组和HBO预处理组脑组织EB含量明显升高(P<0.01)；HBO预处理组脑组织EB含量明显低于高原缺氧组(P<0.01，图1)。结果表明HBO预处理降低了高原缺氧导致的BBB通透性增加。

图1 各组大鼠脑组织EB含量的比较

2.2 脑组织含水量的比较 正常对照组、高原缺氧组、HBO预处理高原缺氧组脑组织含水量分别为(77.03±0.30)%、(82.11±0.26)%、(79.40±0.32)%。高原缺氧组和HBO预处理高原缺氧组脑组织含水量明显高于正常对照组(P<0.01)，HBO预处理高原缺氧组脑组织含水量明显小于高原缺氧组(P<0.01，图2)。结果表明HBO预处理能减轻高原缺氧所致脑水肿。

2.3 EB荧光光斑计数结果 结果(图3)表明：正常对照组除在BBB缺乏的松果体、垂体、后联合见到较多红色荧光光斑，其余脑组织极少见到红色光斑；高原缺氧组、HBO预处理高原缺氧组双侧脑组织均可见到较多红色荧光光斑。3组每10个高倍镜视野荧光光斑计数分别为1.00±0.82、70.71±2.87、41.57±2.64。与正常对照组相比，高原缺氧组和HBO预处理高原缺氧组脑组织红色荧光光斑计数明显上升(P<0.01)，HBO预处理高原缺氧组脑组织红色荧光光斑计数明显小于高原缺氧组(P<0.01，图4)。结果表明HBO预处理降低了高原缺氧导致BBB通透性的增加。

图2 各组大鼠脑组织含水量的比较

图3 荧光显微镜观察脑组织EB分布

图4 各组大鼠脑组织EB荧光光斑数的比较

3 讨 论

预处理为预先给予机体某种刺激，机体器官系统为维持机体内环境相对恒定而发生的积极反应，可以使机体对以后的有害因素产生耐受或适应，从而发挥预防作用[6]。Wada等[7]首次发现HBO预处理可诱导脑组织产生缺血缺氧耐受。随后，众多研究[8-10]均证实反复HBO处理可减轻脑水肿程度，缩小局灶性脑梗死体积，对脑缺血具有明显的保护作用。Guo等[11]研究发现，2.5 atm的高压氧1 h，1次/d，连续处理5 d，能明显改善短暂性大脑中动脉堵塞大鼠神经功能缺损症状，降低BBB的通透性，减少梗死体积，降低出血转化。因此，本研究选择HBO预处理(2.5 atm，98%O2，每天处理1 h，1次/d，连续处理5 d)作为高原缺氧的保护性预处理因素。

EB是一种偶氮染料制剂，其相对分子质量与血浆清蛋白相近，在血液中与血浆清蛋白有很高的亲和力。正常状态下血浆清蛋白无法透过BBB，染色时如神经系统是完整的，与血浆清蛋白结合的EB无法使其着色。相反，如BBB被破坏，EB就可进入神经系统并使其着色。在荧光波长470 nm与540 nm各有1条强峰，680 nm处有1条弱峰[12]。因此，本研究通过荧光显微镜观察EB在脑组织中的红色荧光光斑，通过比色法测定EB在脑组织中的含量，以反映BBB通透性的强弱。

本研究观察HBO预处理对模拟海拔5 000 m高原缺氧时BBB的保护作用，发现其可以降低高原缺氧时大鼠BBB的通透性，减轻脑水肿。但HBO预处理对高原缺氧BBB保护作用的分子机制尚不清楚[13]。有研究[14]认为，ROS可通过上调抗氧化酶、介导ATP敏感性钾通道，(KATP)开放、激活蛋白激酶C(PKC)、诱导一氧化氮合酶(NOS)和热休克蛋白(HSP)生成而产生保护作用。有研究报道高压氧预处理后过氧化氢酶(catalase, CAT)活性明显增加，说明高压氧预处理后CAT活性增强可能是高压氧预处理诱导缺血缺氧耐受的另一因素[15]。

综上所述，本研究发现高压氧预处理可降低高原缺氧大鼠脑水肿及血脑屏障的通过性，提高其对高原缺氧的耐受性，具有广泛的临床应用前景，但具体分子机制有待进一步研究。

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Protection of hyperbaric oxygen preconditioning on blood-brain barrier of plateau hypoxia in rats

ZHOU Hu-chuan, WU Li-hua, HAO Lei, ZOU Can, TANG Xiao-hong, LIU Lei*

Cerebrovascular Center of No.324 Hospital of PLA, Chongqing 400020, China

Objective： To explore the protection of hyperbaric oxygen (HBO) preconditioning on blood-brain barrier of plateau hypoxia in Rats.MethodsSD rats were randomly divided into three groups including normal control group (group A), high altitude hypoxia group (group B) and HBO preconditioning treatment of high altitude hypoxia group (group C), by tail vein injection of 2% Evans blue (EB), and by fluorescence microscopy to observe brain EB spot, we evaluated the changes of BBB permeability by detecting the contents of EB and water in brain tissue through UV spectrophotometer and dry wet weight method, respectively.ResultsThe number of red spots, EB content and brain water content of brain tissues in group A were significantly lower than those in group B and group C (P<0.001). The number of red spots, EB content and brain water content in group B were significantly higher than those in group C (P<0.001).ConclusionsHBO pretreatment can significantly reduce the increase of BBB permeability caused by high altitude hypoxia, and has obvious protective effect on the damage of BBB caused by high altitude hypoxia.

hyperbaric oxygen preconditioning; blood brain barrier; high altitude hypoxia

2016-10-15接受日期2017-08-13

重庆市自然科学基金(CSTC 2014jcyjA 10077)，成都军区应用基础研究面上项目(C12024). Supported by Chongqing Natural Science Foundation (CSTC 2014jcyjA 10077) and Application Basic Research Project of Chengdu Military Area (C12024).

周虎传，硕士，主治医师. E-mail: zhcsjnk120@163.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 023-68762056,E-mail: shenjingneike324@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160955

R -332

A

[本文编辑] 廖晓瑜， 贾泽军