DNA损伤修复在耐辐射奇球菌中的研究进展

韩万春

【摘 要】耐辐射奇球菌是目前世界上最耐辐射的细菌。国内外对其已经有了多年研究。大量的研究结果表明不同的DNA损伤在耐辐射奇球菌体内存在着不同的损伤修复途径。本文主要概述不同的损伤类型在耐辐射奇球菌体内所存在的修复途径。旨在深入了解耐辐射奇球菌的辐射抗性机制，为生物体的辐射防护提供更好的思路。

【关键词】耐辐射奇球菌；DNA损伤；DNA修复；辐射防护

中图分类号： Q937 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2017）17-0059-003

Research Progress on DNA Damage and Repair Mechanisms of Deinococcus radiodurans

HAN Wan-chun

（CNNC Nuclear Power Operations Management Co.，Ltd.，Haiyan Zhejiang 314300，China）

【Abstract】So far，Deinococcus radiodurans is the most radiation resistant bacteria in the world.For researchers， Deinococcus radiodurans as a research object for many years at home and abroad.The research results show that different DNA damages own different repair pathways in it.This article provided an overview of different types of damages own different repair pathways in Deinococcus radiodurans.The aim is to deeply realize the radiation resistance mechanism of Deinococcus raidodurans.Provide better ideas for the radiation protection of organism.

【Key words】Deinococcus radiodurans；DNA damage；DNA repair；Radiation protection

耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans， DR）是一种红色的非致病细菌[1]。因其对极端环境具有很强的抗性而受到科学家的广泛关注。研究人员将其归类到与其亲缘性最高的Deinococcus科和奇球菌属中。研究人员对耐辐射奇球菌进行了大量的研究，通过研究发现其对于由氧化剂、烷化剂，紫外辐射，电离辐射、化学诱变剂等造成的DNA损伤有强大的修复功能[2]。研究这些损伤类型所涉及的损伤机制对于了解耐辐射奇球菌强大DNA损伤修复能力具有重要的意义，也为辐射防护提供更好的思路。

1 耐辐射奇球菌

耐辐射奇球菌最早是在1956年由美国科学家Anderson在经过高剂量电离辐射灭菌的肉罐头中被发现。之后在动物体内、土壤、沙漠、温泉、长寿人群的体内陆续发现了30种左右该属的其他成员。耐辐射奇球菌早期属于Micrococcus属，将其命名为Micrococcus radiodurans，后又因同源性差异将其改为Deinococcus raidodurans。

耐辐射奇球菌的最佳生长温度为30℃。研究发现当低于4℃或者高于42℃时耐辐射奇球菌则会停止生长。在正常条件下，处于指数生长期的耐辐射奇球菌以二联体的形式存在，稳定生长期的耐辐射奇球菌主要以四叠体方式存在。由于其细胞壁上的肽聚糖层较厚，染色后难以脱色，所以革兰氏反应呈阳性。然而其复杂的细胞壁结构与革兰氏阴性菌相似。美国科学家于1999年对耐辐射奇球菌R1进行了全基因组测序[3]，测序结果显示其基因组大小为3.28 Mb， 鸟嘌呤和胞嘧啶平均含量达66.6%。其基因组由染色体Ⅰ，染色体Ⅱ，大质粒以及小质粒构成。对整个基因组预测约含有3187个阅读框（open reading frames，ORFs），基因平均为936 bp。其中2185 ORFs可以找到匹配的同源物，包括通过生物信息学预测出1674个有特定功能的基因和511个未知功能蛋白基因。其余1002个基因功能未知[4]。耐辐射奇球菌在稳定期时较稳定，每个细胞含有4个基因组拷贝，而对数生长期的细胞生长旺盛，每个细胞含有8-10个基因组拷贝。在急性照射15 kGy条件下耐辐射奇球菌可以生存，在剂量率60 Gy/h条件下可以正常生长，显示电离辐射抗性顽强。除了电离辐射抗性之外，其在1000 J/m2高紫外辐照条件下任然可以存活，显示出超强的紫外辐射抗性。同时，耐辐射奇球菌对化学诱变剂丝裂霉素C也表现出较强的抗性。耐辐射奇球菌可以在干燥器内存活六年且保持10%存活率。由于其具有超强的电离辐射抗性，紫外抗性，化学诱变剂抗性及干燥抗性，耐辐射奇球菌被作为模式生物用于抗性机制研究。相应的研究结果也被逐渐用于辐射环境污染修复、农业和军事辐射防护等相关领域[5][6]。

2 耐辐射奇球菌的抗辐射机制的原因

2.1 基因组冗余

耐辐射奇球菌在稳定期每个细胞有4个基因组拷贝，而处于迅速分裂的对数生长期时每个细胞约有8-10个基因组拷贝[7]。研究报道，基因拷贝数目越多细菌对电离辐射产生损伤的抗性越强[8-9]。多重基因组拷贝可以帮助在同源重组修复过程中提供足够的模板。但是，目前为止还没有直接实验证据可以证明耐辐射奇球菌基因组的多重拷贝与其辐射抗性有相关性。endprint

2.2 染色体的类核结构

处于稳定期的耐辐射奇球菌的染色体是以高度紧密的环状结构形式存在，即使在高剂量的急性照射条件下染色体也不發生改变。Levin-Zaidman等人于2003年通过透射电子显微镜观察到耐辐射奇球菌的染色体存在着紧实的环状类核结构，并认为这种类核结构与耐辐射奇球菌的辐射抗性相关[10]。类核结构像网一样可以阻止损伤DNA片段发生游离，使得DNA修复更加快速高效。

2.3 细胞内的锰铁比

Daly在science期刊上发表了锰离子对耐辐射奇球菌的辐射抗性有贡献，研究结果表明耐辐射奇球菌细胞内聚集着高浓度锰离子能够提高细菌的辐射抗性[11]。Daly在PLOS Biology期刊上发表了二价锰离子能够保护蛋白免受损伤，活性完好的修复蛋白能够高效快速的修复DNA损伤位点[12]。此外，研究还发现二价锰离子可以与超氧阴离子自由基发生化学反应。Daly于在Clin. Lab. Med期刊上发表了多种生物体内锰铁比与辐射抗性的关系，锰铁离子比与辐射抗性线性相关[13]。

2.4 类胡萝卜素

在耐辐射奇球菌体内可以大量合成类胡萝卜素。类胡萝卜素能有效的抑制活性氧自由基的产生，起到保护DNA，蛋白及膜蛋白脂类免受氧化损伤的作用[14]。人为将合成类胡萝卜素系统破坏后，在50 mM H2O2压力下其存活率下降了约100倍，说明类胡萝卜素在耐辐射奇球菌的抗性机制中扮演着重要的角色。本实验室研究人员研究发现耐辐射奇球菌的色素合成基因可以转化到乳酸菌中并且成功的合成了红色的色素。这一发现为色素保健乳酸饮品的开发提供了可能，也为广大辐射防护工作者提供了福音。

2.5 胞内高活性抗氧化酶类

抗氧化酶类物质能够高效的清除生物体内活性氧自由基物质[15-16]。耐辐射奇球菌编码三个过氧化氢酶蛋白，四个超氧化物歧化酶蛋白。此外还编码一些抗氧化酶类，包括谷氧还蛋白，硫氧还蛋白还原酶，烷基氢过氧化物还原酶等，这些抗氧化酶类保护细胞免受由于氧化作用对机体造成的损伤。

3 耐辐射奇球菌的体内存在的DNA修复途径

细菌在不同的DNA损伤诱因下，产生不同的损伤类型，包括8-氧鸟嘌呤单链断裂，碱基错配、缺失，嘧啶二聚体，单、双链断裂等。对于不同的损伤类型需要不同的损伤修复途径来完成修复。修复途径主要包括碱基切除修复，碱基错配修复，核苷酸切除修复，非同源末端连接修复等[17]。

3.1 碱基切除修复

碱基切除修复（Base excision repair，BER）可完成由氧化剂、烷化剂等所造成的外源性和内源性DNA损伤修复。其损伤修复途径为，首先在DNA糖苷水解酶作用下识别并切割损伤位点，露出AP位点；接着AP核酸内切酶识别AP位点并切开，由DNA磷酸二酯酶切割脱氧核糖-5-磷酸形成缺口，在聚合酶Ⅰ作用下插入相应碱基，在连接酶的作用下完成修复。在耐辐射奇球菌碱基切除修复过程中，两个烷基化糖基化酶（DR2074和DR2584）参与碱基位点的识别，由剩余的9个DNA糖基化酶参与损伤碱基的切除。核酸内切酶Ⅴ主要移除黄嘌呤和次黄嘌呤[18][19]。此外，耐辐射奇球菌的三个基因（DR0928，DR2438，DR0289）编码三个核酸内切酶Ⅲ移除胸腺嘧啶二聚体。

3.2 核苷酸切除修复

核苷酸切除修复途径（Nucleotide excision repair， NER）在真核和原核生物中广泛存在。在耐辐射奇球菌中，核苷酸切除修复主要以UvrABC和UvrDE两种途径修复形式存在[20]。聚合酶polA参加了这两种修复途径。UvrABC修复途径主要参与切除修复嘧啶二聚体，其中UvrA和UvrB参与结合识别嘧啶二聚体， UvrB和UvrC形成的复合体将损伤位点切除，接着在DNA聚合酶和连接酶的作用下完成修复。UvrDE途径是在缺少UvrA的条件下发现的另一种核苷酸切除修复途径。主要用于修复紫外照射产生的嘧啶二聚体和环丁烷嘧啶二聚体[21-22]。研究结果显示在耐辐射奇球菌中UvrABC修复途径比UvrDE修复途径的贡献要大。

3.4 非同源末端连接修复

非同源末端连接修复途径（Non-homologous end joining，NHEJ）在耐辐射奇球菌中还没有被明确证明存在。但是，最新研究结果发现PprA蛋白可能参与NHEJ修复途径，因为PprA蛋白可以特异性的结合损伤的双链DNA，并在DNA连接酶作用下促使DNA末端连接反应的发生。研究发现若将耐辐射奇球菌的PprA基因敲除，其电离辐射抗性大大降低[23-25]。

3.5 单链退火延伸

单链退火延伸途径（Single strand annealing，SSA）最早由Daly等研究人员在缺失recA基因的耐辐射奇球菌辐照后的修复过程中发现。其工作的基本原理是以多拷贝基因组为模板进行同源单链间的退火配对， DNA聚合酶行使复制与延伸功能，最后DNA连接酶完成修复[26-27]。此途径不依赖于recA蛋白，细菌在受到1 kGy的电离辐照后将会产生此修复响应。

3.6 同源重组修复

同源重组修复（Homologous recombination，HR）是原核生物体内修复断裂DNA的最主要途径。其工作的基本原理是在核酸酶作用下使断裂的DNA露出3末端，以同源的DNA为模板，进行跨损伤缺口修复。在此修复过程中得到包括RecA，RecD，RecF，RecJ，RecG，RecN，RecO，RecR等蛋白的响应 [28]。在细菌中，依赖RecA的同源重组进行修复的主要途径包括：RecBCD途径和RecFOR途径。

在RecBCD途径中，由于耐辐射奇球菌中没有发现RecB和RecC的同源蛋白，表明耐辐射奇球菌没有一整套RecBCD修复途径[29]。然而研究人员发现将recD基因敲除后，耐辐射奇球菌对过氧化氢的敏感性增加[30-31]。endprint

在RecFOR途徑中，RecA主要参与单链缺口的修复。在耐辐射奇球菌DNA双链断裂损伤的重组修复过程中RecA蛋白是不可或缺的。耐辐射奇球菌体内存在着完整的RecFOR修复途径，主要是由解旋酶RecQ和核酸酶RecJ处理出3单链，单链结合蛋白结合到单链上保护单链不被降解[32-33]。接着RecFOR复合体结合到单链上招募RecA进行链交换[34]。最后在DNA聚合酶和连接酶共同作用下完成修复。

4 总结与展望

耐辐射奇球菌是目前为止发现的最耐辐射的细菌。其抗辐射机制与基因组冗余，染色体的类核结构，细胞内的锰铁比，类胡萝卜素，胞内高活性抗氧化酶类等相关。耐辐射奇球菌对于不同损伤也产生了相应的损伤修复途径，其中包括碱基切除修复，核苷酸切除修复，非同源末端连接修复，单链退火延伸，同源重组修复等修复途径。

令辐射防护人员感兴趣的是，目前研究发现，类胡萝卜素对白内障，心血管疾病，特定的肿瘤，机体衰老有一定的保健作用，特别是其可以提高人体的免疫功能。若能开发成相应的保健食品，将会有巨大的应用价值。

耐辐射奇球菌修复过程中涉及多种DNA损伤修复途径，不同的修复途径有大量的相应蛋白参与，解释了其对电离辐射，紫外辐射，干燥以及化学诱变剂引起的突变和致死效应具有超强抗性的原因。对耐辐射奇球菌的深入研究，促进人们对其应用价值的开发，也为生物体辐射防护工作提供更好的思路。

【参考文献】

[1]Battista，J.Against all odds：the survival strategies of Deinococcus radiodurans[J].Annu Rev Microbiol.1997， 51：203-224.

[2]Cox，M.and Battista， J. Deinococcus radiodurans-the consummate survivor[J]. Nat Rev Microbiol. 2005， 3（11）：882-892.

[3]Lin， J.， Qi， R.， et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Deinococcus radiodurans[J]. Science. 1999， 285（5433）：1558-1562.

[4]Makarova， K.， Aravind， L. et al. Genome of the extremely radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans viewed from the perspective of comparative genomics[J]. Microbiol Mol Biol Rev. 2001， 65（1）：44-79.

[5]Lange， C.， Wackett， L.，et al. Engineering a recomninant Deinococcus radiodurans for organopollutant degradation in radioactive mixed waste environments[J]. Nat Biotechnol. 1998， 16（10）：929-933.

[6]Brim， H.， McFarlan， S.， et al. Engineering Deinococcus radiodurans for metal remediation in radioactive mixed waste environments[J]. Nat Biotechnol 2000， 18（1）：85-90.

[7]Hansen， M. Multiplicity of genome equivalents in the radiation-resistant bacterium Micrococcus radiodurans[J]. J Bacterial. 1978， 134（1）：71-75.

[8]Mortimer， R. Radiobiological and genetic studies on a polyploidy series （haploid to hexaploid） of Saccharomyces cerevisiae[J]. Radiat Res. 1958， 9（3）：312-326.

[9]Burrell， A.， Feldschreiber， P.， et al. DNA-membrane association and the repair of double breaks in x-irradiated Micrococcus radiodurans[J]. Biochim Biophys Acta. 1971， 247（1）：38-53.

[10]Levin-Zaidman， S.， Englander， J.， et al. Ringlike structure of the Deinococcus radiodurans genome： a key to radioresistance[J]. Science. 2003， 299（5604）：254-256.

[11]Daly， M.， Gaidamakova， E.， et al. Accumulation of Mn（Ⅱ） in Deinococcus radiodurans facilitates gamma-radiation resistance[J]. Science. 2004， 306（5698）：1025-1028.endprint

[12]Daly， M.， Gaidamakova， E.， et al. Protein oxidation implicated as the primary determinant of bacterial radioresistance[J]. PLoS Biol. 2007， 5（4）：e92.

[13]Daly， M. Modulating radiation resistance： Insights based on defenses against reactive oxygen species in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans[J]. Clin Lab Med 2006， 26（2）：491-504.

[14]Tian， B.， Xu， Z.， et al. Evaluation of the antioxidant effects of carotenoids from Deinococcus radiodurans through targeted mutagenesis， chemiluminescence， and DNA damage analyses[J]. Biochim Biophys Acta. 2007， 1770（6）：902-911.

[15]Wang， P.， and Schellhorn， H. Induction of resistance to hydrogen peroxide and radiation in Deinococcus radiodurans[J]. Can J Microbiol. 1995， 41：170-176.

[16]Kobayashi， I.， Tamura， T.，et al. Characterization of monofunctional catalase KatA from radioresistant bacterium Deinococcus raidodurans[J]. J Biosci Bioeng. 2006， 101：315-321.

[17]Makarova， K.， Aravind， L.， et al. Genome of the extremely radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans viewed from the perspective of comparative genomics[J]. Microbiol Mol Biol Rev. 2001， 65（1）：44-79.

[18]Zharkov， D. Base excision DNA repair[J]. Cell Mol Life Sci. 2008， 65：1544-1565.

[19]Masters， C.， Moseley， B.， et al. AP endonuclease and uracil DNA glycosylase activities in Deinococcus radiodurans[J]. Mutat Res. 1991， 254：263-272.

[20]Saldivar， J.， Wu， X.， et al. Nucleotide excision repair pathway review I： implication in ovarian cancer and platinum sensitivity[J]. Gynecol Oncol. 2007， 107：56-71.

[21]Petit， C.， Sancar， A. Nucleotide excision repair： from E.coli to man[J]. Biochimie. 1999， 81：15-25.

[22]Tanaka， M.， Narumi， I.， et al. Characterization of pathways dependent on the uvsE， uvrA1， or uvrA2 gene product for UV resistance in Deinococcus radiodurans[J]. J Bacteriol. 2005， 187：3693-3697.

[23]Narumi， I.， Satoh， K.， et al. PprA： a novel protein from Deinococcus raidodurans that stimulates DNA ligation[J]. Mol Microbiol. 2004， 54（1）：278-285.

[24]Adachi， M.， Hirayama， H.， et al. Interaction of double-stranded DNA with polymerized PprA protein from Deinococcus raiodurans[J]. Protein Sci. 2014， 23（10）：1349-1358.

[25]Kota， S.， Charaka， V.， et al. PprA， a pleiotropic protein for radioresistance， works through DNA gyrase and shows cellular dynamics during postirradiation recovery in Deinococcus radiodurans[J]. J Genet. 2014， 93（2）：349-354.endprint

[26]Bentchikou， E.， Servant， P.， et al. A major role of the RecFOR pathways in DNA double-strand-break repair through ESDSA in Deinococcus raiodurans[J]. PLoS Genet. 2010， 6（1）：e1000774.

[27]Zahradka， K.， Slade， D.， et al. Reassembly of shattered chromosomes in Deinococcus radiodurans[J]. Nature. 2006， 443（7111）：569-573.

[28]Xu， G.， Wang， L.， et al. RecO is essential for DNA damage repair in Deinococcus radiodurans[J]. J Bacteriol. 2008， 190（7）：2624-2628.

[29]Khairnar， N.， Kamble， V.， et al. RecBC enzyme overproduction affects UV and gamma radiation survival of Deinococcus radiodurans[J]. DNA Repair. 2008， 7：40-47.

[30]Zhou， Q.， Zhang， X.， et al. A new role of Deinococcus radiodurans RecD in antioxidant pathway[J]. FEMS Microbiol Lett. 2007， 271（1）：118-125.

[31]Servinsky， M.， Julin， D.， et al. Effect of a recD mutation on DNA damage resistance and transformation in Deinococcus radiodurans[J]. J Bacteriol. 2007， 189（14）：5101-5107.

[32]Huang， L.， Hua， X.， et al. Three tandem HRDC domains have synergistic effect on the RecQ functions in Deinococcus radiodurans[J]. DNA Repair. 2007， 6（2）：167-176.

[33]Cheng， K.， Xu， H. et al. Structural basis for DNA 5-end resection by RecJ[J]. Elife. 2016， 5：e14294.

[34]Kim， J. and Cox， M. The RecA proteins of Deinococcus radiodurans and Escherichia coli promote DNA strand exchange via inverse pathways[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 2002， 99（12）：7917-7921.endprint