当归芍药散对动脉粥样硬化小鼠的干预作用及DNA甲基转移酶1和PPAR-γ表达的影响

任攀 康群甫 周明学 张蕾 李思耐 刘卫红

当归芍药散对动脉粥样硬化小鼠的干预作用及DNA甲基转移酶1和PPAR-γ表达的影响

任攀 康群甫 周明学 张蕾 李思耐 刘卫红

目的研究当归芍药散对载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠主动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)斑块的干预作用及DNA甲基转移酶1(DNMT1)和PPAR-γ表达的影响。方法将30只8周龄雄性ApoE-/-小鼠西方类型膳食喂养9周，随机分为模型组、立普妥组(阳性对照组)和当归芍药散组(n=10)，药物干预9周后，检测血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血清DNA甲基化水平及DNMTs水平。行苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin staining, HE)，采用IPP图像分析软件测量小鼠主动脉As斑块面积。免疫组化法检测各组小鼠主动脉As斑块内DNA甲基化转移酶1(DNMT1)和过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPAR γ)的表达。结果与模型组相比，当归芍药散组和立普妥组小鼠血清TC、TG水平明显降低(P<0.05)，当归芍药散组小鼠血清HDL-C水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比，当归芍药散组小鼠主动脉As斑块面积显著降低(P<0.01)，当归芍药散组小鼠主动脉斑块内DNMT1表达显著降低(P<0.05)，PPAR γ表达显著升高(P<0.05)。结论当归芍药散可改善As小鼠的血脂水平，减少As斑块面积，具有明确的抗As作用，其机制可能与抑制As小鼠血清甲基化水平和DNMTs 水平，促进As小鼠主动脉斑块内PPARγ表达和抑制斑块内DNMT1表达有关。

动脉粥样硬化； 当归芍药散； DNA甲基化； DNA甲基化转移酶； DNA甲基转移酶1； 过氧化物酶体增殖物激活受体γ

炎症能够导致动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发生，是AS发生发展的病理基础[1]。DNA甲基化是表观遗传学的一种重要的调控方式。新近研究表明，DNA甲基化的异常能够促进AS的发生发展[2]。DNA甲基化受炎症信号通路的影响，DNA甲基化转移酶1(DNMT1)能够促进AS有关的巨噬细胞的炎性激活，并通过抑制PPARγ介导的抗炎作用来促进小鼠AS的发展[3-4]。当归芍药散出自汉代张仲景的《金匮要略》，对AS和高脂血症等疾病有较好的治疗作用[5-8]。既往研究表明，当归芍药散具有明确的抗炎、调脂作用[8-9]，而DNA甲基化与炎症和AS均关系密切，从DNA甲基化调控角度研究当归芍药散抗AS的机制，具有较好的创新性和研究价值。因此，本实验拟采用高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠为AS模型，研究当归芍药散对AS小鼠主动脉粥样硬化的干预作用及对DNA甲基化水平、DNMT1和PPARγ表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验试剂和仪器

血清总胆固醇(total cholesterol，TC)检测试剂盒(批号： 010503040-100301)、血清甘油三酯(triglyceride, TG)检测试剂盒(批号： 010503041-100301)、血清低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)检测试剂盒(批号：010503291-091201)、血清高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)检测试剂盒(批号： 010503290-091201)，购自英科新创(厦门)科技有限公司。小鼠血清DNA甲基化转移酶检测试剂盒(批号： CKE433652M)，购自美国R&D公司。血生化指标检测采用日本奥林巴斯株式会社全自动生化仪(AU400)。美国Image-ProPlus Version 6.0(IPP)图像分析软件。

1.2实验药物

阿托伐他汀钙，商品名立普妥，上海辉瑞制药公司，批号： H20051408。当归芍药散(当归30 g、赤药160 g、茯苓40 g、白术40 g、泽泻80 g、川芎30 g)，中药饮片由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供。

1.3动物及分组

8周龄ApoE-/-小鼠(品系C57BL/6J)，体重18～20 g，购自北京维通利华实验技术有限公司，30只，高脂饲养9周后，所有小鼠随机分为模型组、立普妥组(阳性对照组)和当归芍药散组，每组10只。当归芍药散选取临床等效剂量，并按成人与小鼠的给药剂量换算系数折算成小鼠用量(2.2 g/kg)灌胃给药[8]，每日1次，灌胃给药9周。模型组给予等量的生理盐水。高脂饲料配方为脂肪21%(wt/wt)、胆固醇0.15%的西方类型膳食饲料[10]。各组动物在喂养18周后，颈椎脱臼法处死，眶下静脉丛取血，血清-80℃保存，无菌条件下取心脏，心脏用4%多聚甲醛固定。

1.4血脂检测

采用氧化酶法和直接法检测当归芍药散对高脂喂养18周ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影响。

1.5血清DNA甲基化水平及DNA甲基化转移酶检测

采用高效液相色谱法(HPLC)检测血清DNA 甲基化水平。在100 μL(含DNA约25 μg)的DNA溶液中加入70% 的高氯酸50 μL，在95℃下水解50分钟，然后用浓度为1 mol/L KOH调节pH 3～5，12000 r/min离心5分钟，取上清滤过，注入HPLC中进行检测。采用ELISA法检测血清DNMTs水平。

1.6组织病理

小鼠心底部横断面连续切片，每隔50 μm 连续取6张切片，切片厚5 μm。采用HE病理染色和IPP图像软件分析测量小鼠主动脉As斑块面积：测量管腔面积(LA，mm2)、内弹力膜围绕面积(IELa，mm2)，并计算斑块面积、校正后斑块面积。斑块面积(PA，mm2)= IELa-LA。校正后斑块面积= PA/IELa。

1.7免疫组化检测

免疫组化染色选取小鼠主动脉同一水平位置的斑块，采用两步法测定斑块内DNMT1和PPARγ的表达。(DNMT1抗体稀释度为1∶100，PPARγ抗体稀释为1∶50)，每组均以PBS代替一抗作为阴性对照，在200倍镜下每张切片选取5个不同的视野，对阳性区域累积面积进行定量测定，最后求取斑块内阳性区域面积占斑块面积的百分比。

1.8统计学处理

2 结果

2.1当归芍药散对高脂喂养18周ApoE-/-小鼠血脂的影响

小鼠灌胃9周后，与模型组相比，当归芍药散组和立普妥组小鼠血清TC、TG水平明显降低(P<0.05)。与模型组相比，当归芍药散组小鼠血清HDL-C水平明显升高(P<0.05)，见表1。

2.2当归芍药散对高脂喂养18周ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积的影响

药物干预9周后， 经HE染色和IPP图像软件分析结果显示：与模型组相比，当归芍药散组小鼠校正后主动脉As斑块面积显著降低(P<0.05)，与阳性对照立普妥组之间无显著差异(P>0.05)。见图1、表2。

表1 当归芍药散对高脂喂养18周ApoE-/-小鼠血脂的影响

注： 与模型组相比，aP<0.05。

注：A模型组；B立普妥组；C当归芍药散组

图1 当归芍药散对As小鼠主动脉斑块的影响HE染色图(×100)

注： 与模型组相比，aP<0.05。

2.3当归芍药散对高脂喂养18周ApoE-/-小鼠血清DNA甲基化水平及DNA甲基转移酶的影响

药物干预9周后，结果显示：药物干预9周后，与模型组相比，当归芍药散组小鼠血清DNA甲基化水平及DNMTs水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 当归芍药散对As小鼠血清DNA甲基化水平及DNA甲基转移酶的影响

注： 与模型组相比，aP<0.05。

2.4当归芍药散对高脂喂养18周ApoE-/-小鼠主动脉斑块内PPARγ和DNMT1表达的影响

药物干预9周后，免疫组化结果显示：与模型组相比，当归芍药散组小鼠主动脉斑块内PPARγ表达面积百分比明显增多(P<0.05)，DNMT1表达面积的百分比显著降低(P<0.05)。见图2、表4。

3 讨论

当归芍药散出自汉代张仲景的《金匮要略》，方中当归、川芎、芍药活血化瘀，茯苓、白术、泽泻化痰利水、健脾益气。诸药合用，共奏活血化瘀、化痰祛浊和补虚渗湿之功。AS的中医病机多属本虚标实，本虚即气虚，标实即“痰证”“瘀证”等病症。由痰致瘀，痰瘀互结，是AS的主要病机。因此，本实验根据AS的主要病机，采用了祛湿化痰活血的当归芍药散来治疗AS。有研究表明，当归芍药散通过提高PPARγ的表达，调节血脂，抑制炎症反应，对早期AS具有较好的治疗作用[8]。本实验结果亦提示当归芍药散可改善AS小鼠的血脂水平，其中对TG的作用尤为显著，同时还可以降低小鼠主动脉斑块面积，具有较好的调节血脂和抗AS作用，与董培良等人的研究相一致[5,8-9]。

注：A. 模型组 B.立普妥组 C.当归芍药散组，三组小鼠主动脉斑块内PPARγ 表达。D.模型组 E.立普妥组 F.当归芍药散组，三组小鼠主动脉斑块内DNMT1 表达。图片中箭头所指棕色颗粒为阳性表达。

图2 当归芍药散对As小鼠主动脉斑块内PPARγ和DNMT1表达的影响(×200)

注：与模型组相比，aP<0.05。

DNA甲基化可通过调控与AS有关的炎症免疫细胞和炎症因子来影响AS的发生与发展[11-13]。基因组甲基化水平与冠心病及冠心病风险呈正相关，例如，氧化低密度脂蛋白可通过上调DNMTs活性使DNA甲基化高表达，从而增加AS的风险[4,14]。DNMTs在DNA甲基化的过程中是必不可少的，主要包括DNMT1、 DNMT2、 DNMT3三种。其中，DNMT1在细胞分裂过程中起最主要的、稳定的维持甲基化状态作用[15-16]。在DNMT1特异性表达的小鼠巨噬细胞中，DNMT1能够增加促炎因子的产生，促进AS的进展[4]。本实验中，模型组小鼠血清DNA甲基化和DNMTs处于较高的水平，而当归芍药散组小鼠血清DNA甲基化水平和DNMTs水平显著降低，提示当归芍药散抗AS的机制可能与降低血清DNMTs水平和DNA甲基化水平有关。

PPARγ可以调节细胞的分化、增殖和生存。活化的PPARγ可通过多种信号通路抑制AS斑块中促炎因子的表达，减轻免疫和炎症反应，减少泡沫细胞形成，从而稳定斑块，延缓AS的发展[17]。课题组前期的研究[8]也表明，当归芍药散可能通过调控核转录因子NF-κB和PPARγ受体，抑制小鼠体内代谢性炎性反应，从而对早期AS起到干预作用。

新近研究提示PPAR信号通路的表达受到DNMT1的显著影响。赵静[18]研究表明，PPARγ基因DNA甲基化水平与DNMTs活性呈正相关，DNA甲基化可能通过调控相关炎症基因的表达，提高炎症因子的水平，促进炎症反应，导致AS的发生与发展[19]。Yu等[4]的研究指出，DNMT1能够调控PPARγ的显性表达，促进AS有关的巨噬细胞的炎性激活，并通过抑制PPARγ介导的抗炎作用来促进小鼠AS的发展。DNMT1的下游因子PPARγ能有效调节巨噬细胞炎性细胞因子的产生，抑制小鼠AS的发展。本实验结果显示，与模型组小鼠相比，当归芍药散组小鼠主动脉斑块内DNMT1的表达显著降低，而斑块内PPARγ的表达显著上升，提示当归芍药散可能通过调节DNMT1-PPARγ信号通路来发挥抗AS的作用，而DNMT1和PPARγ可能是当归芍药散抗AS甲基化机制的两个重要靶点。

综上所述，当归芍药散在降低AS小鼠血脂，减少AS斑块面积方面疗效显著，具有明确的抗AS作用，其甲基化机制可能与降低AS小鼠血清DNMTs和DNA甲基化水平以及调节AS小鼠主动脉斑块内PPARγ和DNMT1表达有关。

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EffectsofDangguiShaoyaopowderontheDNMT1andtheexpressionofPPARγinatheroscleroticmice

RENPan，KANGQunfu，ZHOUMingxue，etal.BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing100010，China

Correspondinganthor：LIUWeihong，E-mail：wh.l-007@163.com

ObjectiveTo study the effects ofDangguiShaoyaopowder on the expression of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) and PPARγ in apolipoprotein E knockout (ApoE-/-) mice with atherosclerosis.MethodsThirty 8 week-old male ApoE-/-mice were fed with high fat diet for 9 weeks, and the mice were randomly divided into the control group, the Lipitor (positive control group), theDangguiShaoyaopowder group (n=10). The levels of total cholesterol (TC), triglycerides (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) in serum were detected. The level of DNA Methylation and the DNMTs in serum were detected. HE staining was used to measure the area of atherosclerosis plaque of mice. Immuno-histochemical staining and image analysis were used to measure the expressions of DNMT1 and PPARγ in the atherosclerosis plaques of mice.ResultsCompared with the model group, the TC and TG levels ofDangguiShaoyaopowder group and Lipitor group were significantly decreased (P<0.05), the HDL-C levels ofDangguiShaoyaopowder group were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the aorta As plaque area was significantly decreased inDangguiShaoyaopowder group (P<0.05). The expressions of DNMT1 of theDangguiShaoyaopowder group were significantly reduced(P<0.05) while the expressions of PPARγ were significantly increased (P<0.05).ConclusionDangguiShaoyaopowder can improve the blood lipid level and the plaque area of As mice. The mechanism may be related to the reduction of DNA methylation level and the DNMTs level in serum, and also related to the inhibition of DNMT1 expression, and the promotion of PPARγ expression in mice with As.

Atherosclerosis；DangguiShaoyaopowder； DNA methylation； DNA methyltransferase； DNA methyltransferase 1； Peroxisome proliferator activated receptor gamma

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.009

2017-06-15)

(本文编辑： 董历华)

国家自然科学基金(81573735)；北京市自然科学基金(7142037)

100010 北京，首都医科大学附属北京中医医院北京市中医研究所[任攀(硕士研究生)、康群甫(硕士研究生)、周明学、张蕾、李思耐、刘卫红]

任攀(1990- )，2015级在读硕士研究生。研究方向：中西医结合心血管病研究。E-mail：renpanzy@163.com

刘卫红(1968- )，女，博士，硕士生导师，主任医师。研究方向：中医药防治心血管病的疗效评价及作用机制研究。 E-mail：wh.l-007@163.com