慢性束缚应激抑郁症大鼠模型的复制及逍遥散对海马色氨酸代谢途径的调节作用

焦海燕 严志祎 姜幼明 刘玥芸 陈家旭

·论著·

慢性束缚应激抑郁症大鼠模型的复制及逍遥散对海马色氨酸代谢途径的调节作用

焦海燕 严志祎 姜幼明 刘玥芸 陈家旭

目的通过慢性束缚应激方法复制大鼠抑郁症模型，并观察海马色氨酸代谢途径的变化与逍遥散的调节作用。方法将24只雄性SD大鼠随机分成正常组、模型组、逍遥散组与氟西汀组。采用21天慢性束缚应激的方法复制大鼠抑郁症模型，通过大鼠体重变化、糖水偏好实验、新环境抑制进食实验、旷场试验对模型进行评价。采用ELISA法测定各组大鼠海马色氨酸(tryptophan，Trp)与5-羟色胺(5-HT)的含量。结果模型组大鼠糖水偏好量和新环境进食时间与正常组大鼠相比有显著差异(P<0.01)；旷场试验的中央区进入次数、中央区停留时间以及总穿格次数与正常组相比均有统计学差异(P<0.01，P<0.05)。ELISA结果显示，模型组大鼠海马5-HT含量显著低于正常组(P<0.01)，而逍遥散组和氟西汀组海马5-HT含量明显高于模型组(P<0.05，P<0.01)；模型组大鼠海马中色氨酸的含量较正常组明显增加(P<0.01)。结论在慢性束缚应激抑郁症大鼠海马中存在色氨酸代谢途径的异常，这与抑郁症的发病密切相关，且逍遥散能够通过对海马色氨酸代谢的调节起到一定的抗抑郁作用。

抑郁症； 色氨酸代谢途径； 5-羟色胺； 逍遥散

抑郁症是一种以显著而持久的心境低落为主要特征的情感障碍类精神疾病，其典型表现有情绪低落、思维迟钝、对工作失去兴趣、语言动作减少、不思饮食、负罪感以及自觉无用、有自杀倾向等。抑郁症的发病机制尚不明确，目前临床上运用的抗抑郁药主要是基于“单胺类神经递质假说”研发，虽具有一定治疗效应，但存在效率低、起效慢等缺点。中医学对抑郁症的认识较早，但并没有抑郁症之病名，古代文献多把它归在郁证中，属中医学情志病范畴。抑郁症中医证候要素研究表明抑郁症的病位在肝和脾，主要病性为气郁、气虚[1]，肝失疏泄，脾失健运，脏腑气机紊乱，阴阳失调等是郁证的主要病机[2]。肝郁脾虚证为抑郁症的常见证型，而逍遥散作为疏肝健脾的名方，在对抑郁症治疗方面有较好的理论及临床基础。本实验通过慢性束缚应激的方法复制大鼠抑郁症模型，通过糖水偏好实验、新环境抑制进食实验及旷场实验对模型进行评价。采用ELISA法检测大鼠海马色氨酸与5-HT的含量，并观察逍遥散对中枢色氨酸代谢的影响，探索抑郁症的中枢机制，以期进一步为逍遥散抗抑郁作用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠，体重(200±20)g，共24只。所有大鼠在开始进行实验前于北京中医药大学动物三级实验室适应性饲养7天，室温为(22±2)℃，相对湿度60%±5%，环境保持安静，正常光照、昼夜节律。动物许可证号：SCXK(Beijing)2012-0001。

1.2药物

逍遥散出自《太平惠民和剂局方》(北柴胡30 g、茯苓15 g、当归30 g、白芍30 g、白术30 g、生姜10 g、炙甘草15 g、薄荷10 g)，购自北京同仁堂饮片有限责任公司，由中日友好医院中药制剂室按照原方配伍比例煎煮、浓缩成药粉，1 g药粉含生药量3.18 g，使用时需用去离子水配制成混悬液。盐酸氟西汀胶囊(Patheon France)规格为20 mg/粒，购自礼来苏州制药有限公司。

1.3主要试剂和仪器

大鼠束缚架(自制)，旷场箱(自制)，WV-CP470摄像头(Panasonic，Japan)，ACS-2EAS型电子秤(北京市菲姆斯科技开发公司)，Etho Vision3.0分析软件(Noldus)，Serotonin ELISA kit(Enzo)，Tryptophan ELISA kit(Abnova)，低温高速离心机(Eppendorf)，37℃恒温箱(BINDER)，全波长扫描酶标仪(Thermo Scientific)。

1.4模型制备

采用体重随机数分组法对24只SD大鼠进行随机分组，分为正常组、模型组、逍遥散组、氟西汀组，共4组，每组6只。采用21天慢性束缚应激的方法复制大鼠抑郁症模型，大鼠束缚架底座为长20 cm、宽10 cm、厚1 cm木质结构，上方束缚台长22 cm，宽6.6 cm，束缚台的两侧各有两条可以调节的粘贴带，用来束缚实验大鼠的胸腹部。

正常组大鼠采用常规方法饲养，不对其进行造模，其余3组大鼠每天束缚3小时。每日于束缚前1小时对模型组大鼠灌服去离子水，逍遥散组大鼠灌服逍遥散混悬液，氟西汀组灌服氟西汀溶液，并按人体有效用药剂量进行换算。逍遥散给药量为每100 g大鼠体重给药0.61 g，氟西汀给药量为每100 g体重0.2 mg，大鼠的灌胃容积为每100 g体重1 mL。造模持续21天。通过观察大鼠体重变化，并采用糖水偏好实验、旷场实验、新环境抑制进食实验对大鼠抑郁症模型进行评价。

1.5取材

造模结束后进行取材：首先用10%水合氯醛注射大鼠腹腔，使其处于深度麻醉状态，冰上取脑组织并分离海马，每只大鼠称取100 mg海马组织放置在1.5 mL EP管中，然后加入1000 μL已经预冷的1×PBS溶液，匀浆后存放于-20℃冰箱，反复冻融2次后，于4℃，5000 r/min条件下离心5分钟，分装所得蛋白上清液存放在-80℃冰箱备用。

1.6ELISA实验

1.6.1 5-HT含量测定 实验前将Serotonin ELISA kit试剂盒从4℃冰箱取出，放至室温后把所用试剂离心混匀；将500 μL浓度为500 ng/mL的蛋白标准品原液分别稀释为125、31.25、1.95、0.49 ng/mL 4个浓度；打开96孔板，根据加样顺序分别加入缓冲液和标准品溶液，每个待测样品三个复孔，每孔100 μL；加入5-HT抗体，用封板膜将96孔板密封，室温下摇床孵育2小时，清洗3次后通过拍打除去96孔板中残留液体；加入显影液和终止液后立刻在酶标仪下进行读数，得到各孔的OD值，然后通过标准品的OD值绘制出5-HT蛋白浓度的标准曲线，计算出各个样品蛋白含量，结果和海马重量进行换算，得到5-HT的含量和海马组织的质量比，以“ng/mg”表示。

1.6.2 色氨酸含量测定 提前将Tryptophan ELISA kit试剂盒从冰箱拿出，放至室温，并把所用试剂离心、混匀；然后将25 μL蛋白标准品Standard A-F(浓度依次为0、2.5、7.5、25、75、250 μg/mL)、待测样品和对照蛋白品分别加入96孔板的相应孔，每个样品3个复孔；加入50 μL色氨酸抗体，4℃孵育过夜；结束后倒掉板中液体，加入清洗液清洗3次，通过拍打除去残留液体；加入酶标抗体工作液，孵育30分钟后倒掉板中液体，加入清洗液清洗；加入显影液，室温避光孵育30分钟后加入终止液，混匀后立即在酶标仪下读数，得到各孔的OD值，然后通过标准品的OD值绘制色氨酸蛋白浓度的标准曲线，计算样品蛋白含量，再与海马组织重量进行换算，得到色氨酸的含量和海马的质量比，以“ng/mg”表示。

1.7统计学处理

2 结果

2.1各组大鼠体重变化情况

在造模开始时，各组大鼠的体重差异无统计学意义；造模第7天，模型组大鼠体重较正常组与氟西汀组大鼠明显降低(P<0.01)；造模第14天和21天结果显示，正常组、逍遥散组和氟西汀组大鼠体重显著高于模型组(P<0.01)。见表1。

2.2糖水偏好实验和新环境抑制进食实验结果

糖水偏好实验的结果显示，模型组大鼠的糖水消耗率低于其余三组，差异显著(P<0.01)。新环境抑制进食实验结果表明，模型组大鼠的进食时间明显较正常组显著延长(P<0.01)，逍遥散组与氟西汀组大鼠进食时间与模型组大鼠无统计学差异。见表2。

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

2.3旷场实验结果

中央区进入次数：造模开始前，各组大鼠中央区进入次数经过计数无明显差异；造模第21天，模型组大鼠中央区进入次数显著低于其余三组(P<0.05，P<0.01)。中央区停留时间：造模开始前，各组大鼠中央区停留时间并无明显差异；造模第21天，模型组大鼠中央区停留时间显著高于逍遥散组、正常组和氟西汀组大鼠(P<0.05，P<0.01)。总穿格数：造模开始前，各组大鼠总穿格数并无明显差异；造模第21天，模型组大鼠总穿格数明显低于正常组和逍遥散组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4各组大鼠海马色氨酸与5-HT的含量

5-HT蛋白浓度标准曲线为y=-0.129In(x)+0.9394，R2=0.995；色氨酸蛋白浓度标准曲线为y=-0.148In(x)+1.0092，R2=0.993。

与正常组相比， 模型组大鼠海马5-HT含量显

表1 各组大鼠体重比较

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

著降低(P<0.01)，而逍遥散组和氟西汀组海马5-HT含量明显高于模型组(P<0.05，P<0.01)；与其余三组相比，模型组大鼠海马的色氨酸蛋白含量最高，有统计学差异(P<0.01)。见表4。

表3 各组大鼠旷场实验结果

注： 与正常组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05，dP<0.01。

表4 各组大鼠5-HT和色氨酸蛋白含量

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，cP<0.01。

3 讨论

本研究通过慢性束缚应激的造模方法复制抑郁症大鼠模型，选用逍遥散作为干预药物，并以西药氟西汀为对照药物。从大鼠体重的统计结果可以看出，模型组大鼠与其余三组大鼠的体重差异逐渐增加，表明束缚应激对大鼠的体重有较大影响。糖水偏好实验作为公认的抑郁样行为评价方法，通过测定大鼠对糖水的偏好程度，判断大鼠精神状态与抑郁程度[3]。本实验结果模型组大鼠对糖水的偏好程度显著低于正常组，表明了其抑郁样行为的发生。新环境抑制进食实验则是通过实验动物在陌生环境中进食所需的时间来判断动物的精神、行为改变[4]，本实验模型组大鼠在新环境中的进食时间较正常组大鼠明显延长，进一步反映了模型大鼠的抑郁样改变。旷场实验是用来评价动物处在陌生环境中时所产生的自主探究行为的一种实验方法，常用于抑郁症的模型评价[5]。本研究选取大鼠中央区进入次数、中央区停留时间以及总穿格次数进行了分析，当大鼠处于焦虑或抑郁状态时，在其活动时会主动避开空旷的中央区域，选择在相对安全的旷场箱体四周活动，减少进入中央区的次数，而当大鼠一旦进入开阔的中央区域时，出现抑郁样改变的大鼠会对向四周移动产生迟疑，从而增加了中央区停留时间。总穿格次数则主要反映了实验动物的运动情况，当动物精神抑郁时自主活动的欲望及运动能力也会随之下降。在本实验中，与正常组相比，模型组大鼠的中央区进入次数、中央区停留时间及总穿格次数均有显著差异，这表明慢性束缚应激导致的模型大鼠出现了抑郁样的行为改变，再根据体重变化、糖水偏好以及新环境抑制进食实验的结果可以推断，21天慢性束缚应激大鼠抑郁症模型的复制基本成功。另外，从实验结果可以看出，逍遥散对慢性束缚应激抑郁症模型大鼠的体重和行为表达均有一定的调节作用。

有研究表明，抑郁症是由脑内去甲肾上腺素与5-HT缺乏所致[6]，中枢5-HT活性的降低可增加机体对外界应激的敏感性，产生精神状态的改变，从而引起抑郁、焦虑等。5-HT是色氨酸代谢途径中最重要的一种中间产物，当机体因应激而引起代谢速度加快时，可导致色氨酸水平降低，进而使5-HT的含量随之下降，引起精神疾患的发生[7]。从本研究的结果可以看出，模型组大鼠海马内色氨酸的含量升高，而5-HT的含量下降，说明应激可能抑制了海马内色氨酸生成5-HT的代谢途径；逍遥散对抑郁症模型大鼠海马内色氨酸代谢及5-HT的合成均有一定调节作用，表明逍遥散能使色氨酸更多地向5-HT方向转化，对5-HT系统功能紊乱有一定的恢复作用，以此发挥抗抑郁的治疗作用。

综上所述，本研究成功复制了大鼠抑郁症模型，并通过ELISA测定了慢性束缚应激抑郁症大鼠海马5-HT与色氨酸的蛋白含量，进一步论证了海马内色氨酸和5-HT含量的变化与抑郁症发病的关联性。逍遥散作为治疗情志疾病的经典方剂，对海马色氨酸代谢途径以及5-HT的含量均有调节作用。脑内5-HT含量减少与情绪改变以及精神疾患的发生密切相关[8]，因而对色氨酸代谢与5-HT合成的深入研究能够进一步为抑郁症的发病机理，以及逍遥散治疗抑郁症的临床应用提供更完善的科学依据。

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ModelofdepressionratswithchronicimmobilizationstressandeffectsofXiaoyaosanonthechangeoftryptophanmetabolismpathway

JIAOHaiyan，YANZhiyi，JIANGYouming，etal.InstituteofTCM,BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

Correspondingauthor：CHENJiaxu，E-mail:chenjx@bucm.edu.cn

ObjectiveTo establish the depression rat model by chronic immobilization stress method，and observe the change of tryptophan metabolism pathway in hippocampus and the regulation ofXiaoyaosan.Methods24 SD rats were randomly divided into normal group，model group，Xiaoyaosangroup and fluoxetine group，the 21 days depression rat model was made by chronic immobilization stress method，and the model was evaluated by bodyweight change，sucrose preference test，novelty suppressed feeding test and open field test. ELISA method was used to determine the contents of tryptophan and 5-HT in hippocampus.ResultsThe results of sucrose preference test and novelty suppressed feeding test showed that there was a significant difference between model group and normal group (P<0.01)，the central enterance，central residence and total cross number of rats in model group were significantly different compared with that of normal group (P<0.01，P<0.05). The ELISA results showed that the content of 5-HT in hippocampus of rats in model group was significantly lower than that of normal group (P<0.01)，the contents of 5-HT of rats inXiaoyaosangroup and fluoxetine group were significantly higher than that of model group (P<0.05，P<0.01); the content of tryptophan in model group was significantly higher than normal group (P<0.01).ConclusionThere existed abnormity in the tryptophan metabolic pathway of depression model rat by chronic immobilization stress，which was closely related to the incidence of depression，andXiaoyaosancould possess antidepressant effect by regulating the tryptophan metabolism in hippocampus.

Depression； Tryptophan metabolism pathway； 5-HT；Xiaoyaosan

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.003

2017-04-21)

(本文编辑：董历华)

国家自然科学基金面上项目(81473597)；国家自然科学基金重点项目(81630104)；北京中医药大学2016年校级自主课题(2016-JYB-XS012)

100029 北京中医药大学中医学院[焦海燕(硕士研究生)、严志祎(博士研究生)、姜幼明、刘玥芸、陈家旭]

焦海燕(1991- )，女，2014级在读硕士研究生。研究方向：证候的生物学基础。E-mail：2548489775@qq.com

陈家旭(1966- )，博士，教授，博士生导师。研究方向：证候的生物学基础。E-mail:chenjx@bucm.edu.cn