利用ARMS-Tm-shift-qPCR技术检测水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq

陈峰，徐建第*，姜明松，张全芳，朱文银，李广贤，周学标，杨连群，

(1.山东省水稻研究所，山东 济南 250100；2.山东省农业科学院生物技术研究中心，山东 济南 250100)

利用ARMS-Tm-shift-qPCR技术检测水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq

陈峰1，徐建第1*，姜明松1，张全芳2，朱文银1，李广贤1，周学标1，杨连群1，2

(1.山东省水稻研究所，山东 济南 250100；2.山东省农业科学院生物技术研究中心，山东 济南 250100)

Wx-mq基因是水稻低直链淀粉性状控制基因，与米饭食味品质密切相关。本研究根据水稻控制低直链淀粉含量Wx-mq基因第497位存在的G>A单核苷酸变异，将基于SYBR GreenⅠ的ARMS和Tm-shift的两种实时PCR基因分型方法相结合，建立了可准确区分Wx-mq基因第497位的GG纯合、AA纯合及GA杂合三种类型的实时荧光定量PCR体系。试验表明这种基于SYBR GreenⅠ的ARMS-Tm-shift实时PCR基因分型方法无需合成探针，试验设计简单，是一种快速、简便、特异性好的基因分型方法，可用于Wx-mq基因分子标记辅助育种中基因的高通量分型。

水稻；Wx-mq基因；低直链淀粉含量；ARMS-Tm-shift-qPCR

近年来, 随着人民生活水平的提高, 消费者对稻米食味品质的要求越来越高。研究表明，直链淀粉含量是决定米饭质地和食味品质的重要因素[1,2]。低直链淀粉含量的水稻其米饭表面光泽透亮，综合了糯米的柔软性和粳米的弹性, 适口性好，食味品质佳，具有较高的商品性。

水稻低直链淀粉基因Wx-mq是通过化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基脲处理日本水稻品种越光而获得的低直链淀粉含量变异基因，序列分析表明，与来自野生型亲本越光中的Wx基因相比，Wx-mq在编码区发生了2个碱基的替换，其中497位的G突变为A，595位的T突变为C，从而使相应的氨基酸序列产生了2个错义突变，即位于第4外显子的精氨酸和第5外显子的色氨酸均突变为组氨酸，推测这2个错义突变是造成直链淀粉含量下降的原因。低直链淀粉含量基因Wx-mq在稻米食味品质改良中的作用尤为重要，如何在育种中快捷、准确地对其基因型进行鉴定、选择已成为亟待解决的技术难题。Sato等[2]针对Wx-mq基因第497位单核苷酸变异设计了能区分Wx-mq基因型的显性PCR标记；Chen等[3]根据该突变位点设计了能准确区分三种基因型的CAPS标记；陈涛等[4]利用四引物扩增受阻突变体系(Amplification Refractory Mutation System, ARMS)进行等位基因特异扩增来检测水稻低直链淀粉含量基因。由于Wx-mq基因仅存在单碱基的变异，采用普通的分子生物学技术(如DNA测序、PCR酶切法)对其基因型(特别是杂合基因型)进行区分，试验过程往往比较烦琐，且存在PCR产物污染等问题。因此，有必要尝试采用新的方法对水稻Wx-mq基因型进行快速鉴定。

郑薇薇等[5]采用序列特异的ARMS引物对原癌基因K-ras进行扩增, 建立了以SYBR GreenⅠ荧光染料为实时PCR指示剂的ARMS实时PCR基因分型体系，无需合成探针、设计简单，是一种快速、 简便、 经济、准确的基因分型方法。本研究则将ARMS法与Tm-shift法结合，建立基于SYBR GreenⅠ能同时区分Wx-mq基因第497位的GG纯合、AA纯合及GA杂合三种基因型的实时荧光PCR基因分型体系，旨在实现对水稻低直链淀粉基因Wx-mq第497位单核苷酸多态性快速、高效、精确的检测。

1 材料与方法

1.1供试材料

供试水稻材料包括5个含低直链淀粉含量基因Wx-mq的水稻品种关东194、南粳46、南粳9108、JS06、JS10(均引自江苏省农业科学院粮食作物研究所)，4个直链淀粉含量正常的水稻品种日本晴、圣稻18、徐稻3号、圣稻15，以及关东194/圣稻15、南粳46/圣稻18杂种F1代，JS06/圣稻18的F3代群体，南粳9108/津稻263的F2代群体。

1.2引物设计

用于Wx-mq基因497位G>A位点检测的Tm-shift和ARMS方法结合引物设计为: 野生型GG上游引物(Wx-mqW): 5′-CGCCCGTCCCGCCGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3′，突变型AA上游引物(Wx-mqM)：5′-GATTACCGGTTTTTCCATTGCTACAAACA-3′，下游引物(Wx-mqR)：5′-GCGAAAGGTAAACTAATGATGACTCCAC-3′，其中野生型GG上游引物的5′端添加14 bp的序列5′-CGCCCGTCCCGCCG-3′；突变型AA上游引物的5′端添加8 bp的短序列5′-GATTACCG-3′；2条ARMS引物分别在3′末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，同时在其3′末端倒数第3位增加一个碱基错配，进行实时荧光定量PCR扩增，每个样本的突变检测分单管进行。

1.3基因组DNA的准备及反应体系

采用CTAB法提取叶片DNA，将纯化后的DNA用Nanodrop分光光度计定量，分取一部分定量到100 ng/μL水平，备用；引物溶解，稀释至100 μmol/L原始浓度，-20℃保存备用。荧光定量PCR反应体系(20.0 μL)：SYBR PremixExTaqMix(2×)10.0 μL，Primer mix(100 μmol/L)1.0 μL，DNA Template(10 ng/μL)2.0 μL，ROX ref(50×)2.0 μL，双蒸水补齐至20.0 μL。反应程序：①预变性：95℃预变性2 min；②PCR反应：95℃下变性5 s，60℃下复性35 s，40个循环；③熔解曲线分析：95℃ 0 s 20℃/s，65℃ 15 s 20℃/s，95℃ 0 s 0.1℃/s。

2 结果与分析

2.1不同水稻品种及F1代Wx-mq基因型的检测

对9个水稻品种(系)及杂种F1的DNA 进行ARMS-Tm-shift-qPCR检测。常规粳稻品种(野生型)日本晴、圣稻18、徐稻3号、圣稻15均出现单峰且Tm值为(83.09±0.50)℃的熔解曲线(图1)，且有Ct<35的单一扩增曲线(图2)。5个含有低直链淀粉含量基因Wx-mq的水稻材料关东194、南粳46、南粳9108、JS06、JS10均出现单峰且Tm值为(81.01±0.50)℃的熔解曲线(图3)，且有Ct<35的单一扩增曲线(图4)。当样本为杂合型(关东194/圣稻15、南粳46/圣稻18杂种F1代)，熔解曲线有双峰，Tm值分别为(83.09±0.50)℃和(81.01±0.50)℃(图5)，双条扩增曲线的Ct<35(图6)。

结果显示，ARMS-Tm-shift-qPCR检测结果与表型完全一致。因此，利用该方法可以快速、准确地鉴定和区分含Wx-mq纯合基因型的低直链淀粉水稻材料、常规粳型材料及杂合体材料。

图1野生型(GG)定量PCR熔解曲线

图2 野生型(GG)定量PCR扩增曲线

图3 突变型(AA)定量PCR熔解曲线

图4 突变型(AA)定量PCR扩增曲线

图5 杂合型(GA)定量PCR熔解曲线

图6 杂合型(GA)定量PCR扩增曲线

2.2分离群体Wx-mq基因检测

对2个分离群体(JS06/圣稻18的F3代群体和南粳9108/津稻263的F2代群体)于分蘖盛期，挂牌选取120个单株叶片，进行Wx-mq基因检测，共检测到突变型(AA)单株57株、野生型(GG)单株33株、杂合型(GA)单株40株。成熟后对挂牌单株收获，进行胚乳外观考查，结果表明，分子标记检测为突变型和野生型的单株与表型鉴定完全一致。因直链淀粉含量的性状表达属于胚乳性状，胚乳是三倍体组织，胚乳性状是母株的子代性状，因此对于杂合型单株，其外观呈现分离表型[6]。

3 讨论与结论

目前，水稻优质食味米品种选育越来越受到育种家的重视，并育成了一批优质米品种。例如，江苏省农业科学院粮食作物研究所以高产粳稻品种武香粳14作母本、以具有暗胚乳突变基因的优质粳稻品种关东194作父本配制杂交组合，利用与暗胚乳突变基因Wx-mq直接相关的分子标记进行辅助选择，育成含有暗胚乳突变基因Wx-mq的优良食味粳稻新品种南粳46、南粳5055、南粳9108[7-9]。山东省水稻研究所与江苏农业科学院粮食作物研究所合作，选育出优质食味半糯品种南粳505，2017年通过山东省审定。北方稻作科技协会从2007年开始组织了全国优良食味粳稻品评活动，评选出宁粳43、龙稻7号、吉粳509、宁9108等优质食味粳稻品种，推动了优质米育种及食味粳米开发[10]。

本研究采用ARMS-Tm-shift-qPCR技术对水稻低直链淀粉基因Wx-mq进行检测，试验表明这种基于SYBR GreenⅠ的ARMS-Tm-shift实时PCR基因分型方法，无需合成探针，试验设计简单，在苗期即可完成对Wx-mq不同基因型的鉴定，是一种快速、简便、经济、特异性好的基因分型方法，可以提高育种工作的预见性和选择效率，可用于Wx-mq基因分子标记辅助育种中基因的高通量分型。

[1] Matsuo T, Futsuhara Y, Kikuchi F, et al．Science of the rice plant (Vol.3:Genetics)[M]．Rural Culture Association, Tokyo, Japan, 1990:351-354．

[2] Sato H, Suzuki Y, Sakai M, et al．Molecular characterization ofWx-mq, a novel mutant gene for low-amylose content in endosperm of rice (OryzasativaL. )[J]. Breeding science, 2002, 52(2): 131-135．

[3] Chen T, Zhang Y D, Zhao L, et al．A cleaved amplified polymorphic sequence marker to detect variation inWxlocus conditioning translucent endosperm in rice[J]．Rice Sci., 2009, 16(2): 206-110.

[4] 陈涛，骆名瑞，张亚东，等. 利用四引物扩增受阻突变体系PCR 技术检测水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq[J]. 中国水稻科学，2013，27(5)：529-534.

[5] 郑薇薇, 梁基选, 李庆阁. ARMS 实时PCR 基因分型特异性的研究[J].厦门大学学报(自然科学版)，2005，44(增刊)：135-139.

[6] 莫惠栋.谷类作物胚乳品质性状的遗传研究[J]. 中国农业科学，1995，28(2)：1-7.

[7] 王才林，陈涛，张亚东，等.通过分子标记辅助选择培育优良食味水稻新品种[J].中国水稻科学，2009，23(1)：25-30.

[8] 王才林，张亚东，朱镇，等.优良食味粳稻新品种南粳9108的选育与利用[J].江苏农业科学，2013，41(9)：86-88.

[9] 王才林，张亚东，朱镇，等.优良食味粳稻新品种南粳5055的选育及利用[J].农业科技通讯，2012(2)：84-88.

[10] 孙雅君，孟庆虹，王才林，等. 第十三届粳稻发展论坛之15′全国优良食味粳稻品评结果报告[J]. 北方水稻，2015，45(5)：1-5.

DetectionofWx-mqGeneforLow-AmyloseContentbyARMS-Tm-shift-qPCRTechnology

Chen Feng1，Xu Jiandi1*，Jiang Mingsong1，Zhang Quanfang2，Zhu Wenyin1，Li Guangxian1，Zhou Xuebiao1，Yang Lianqun1，2

(1.ShandongRiceResearchInstitute，Jinan250100，China; 2.BiotechnologyInstitute，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan250100，China)

Wx-mqgene is a low amylose trait controlled gene and closely relates with the eating quality of rice. According to the rice low amylose starch content control geneWx-mqNo. 497 position existing G>A single nucleotide variants, two real-time PCR genotyping methods, ARMS and Tm-shift based on SYBR Green I, was combined to establish the fluorescence real-time quantitative PCR system, which could accurately distinguish the GG homozygote, AA homozygote and GA heterozygosis ofWx-mqgene No. 497 position. The experiment results showed that the ARMS-Tm-shift real-time PCR genotyping method based on SYBR Green I did not need probe synthesis with simple designs. It was a rapid, simple and specific genotyping method. It could be used in high-throughput genotyping ofWx-mqgene in molecular marker assisted breeding.

Rice;Wx-mqgene; Low-amylose content; ARMS-Tm-shift-qPCR

S511.01

A

1001-4942(2017)10-0015-05

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.003

2017-06-13

国家重点研发计划项目(2017YFD0100505)；国家水稻产业体系济宁综合试验站(CARS-01-60)；国家科技支撑计划子课题(2015BAD01B02-1-3)；山东省水稻产业体系项目(SDAIT-17-01)；山东省重点研发计划项目(2017GNC11111)；山东省农业科学院科技创新重点项目(2014CXZ10-5)；山东省农业科学院科技创新工程项目(CXGC2016A11)；山东省农业科学院重大成果培育项目(2016CGPY09)

陈峰(1979—)，男，助理研究员,山东曲阜人，主要从事水稻育种。E-mail：Chenfeng7902@163.com 徐建第(1979—)，男，副研究员，山东昌邑人，主要从事水稻分子育种。E-mail:Xjiandi79@163.com

*同为第一作者。

杨连群(1961—)，男，研究员，山东汶上人，从事水稻遗传育种研究。 周学标(1967—)，男，研究员，山东金乡人，从事水稻遗传育种研究。