开心解郁丸对抑郁大鼠神经元可塑性调控基因表达的影响＊

潘菊华，王彦云，李多娇，陈宇霞，陈 朝，张 颖，黄世敬

（中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

开心解郁丸对抑郁大鼠神经元可塑性调控基因表达的影响＊

潘菊华，王彦云，李多娇，陈宇霞，陈 朝，张 颖，黄世敬＊＊

（中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

目的：研究开心解郁丸治疗抑郁症的疗效及机理。方法：采用慢性不可预见性温和应激叠加孤养大鼠抑郁模型研究开心解郁丸对糖水偏嗜、水迷宫等抑郁样行为及神经元可塑性相关基因糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、环磷腺苷反应元件结合蛋白（CREB）、5-羟色胺受体2C（HTR2C）、血管内皮生长因子（VEGF）的调控作用。结果：大鼠抑郁模型中，开心解郁丸可显著增加糖水消耗百分比，一定程度上增加水迷宫逃避潜伏期，明显降低神经元可塑性相关基因GSK-3β和HTR2C mRNA、明显升高CREB和VEGF mRNA。结论：开心解郁丸对抑郁大鼠有一定的抗抑郁作用，可能与调节神经元可塑性相关基因GSK-3β、CREB、HTR2C和VEGF有关。

开心解郁丸 抑郁 大鼠 神经元可塑性

抑郁症为常见的情感精神障碍性疾病，发病率为3%-11%，致残率高，易复发，自杀率达15%，是全球疾病负担最重的三大疾病之一。目前抗抑郁药存在延迟起效、缓解率低、耐受性差、易出现毒副反应等问题。根据多年治疗抑郁症的经验，本课题组提出“虚气留滞”病机理论，即元气亏虚，气血相失，气血津液运行失常，从而导致气滞、血瘀、痰凝、络阻等，并提出益气开郁的治法[1]。运用开心散合四逆散加减形成的中药制剂开心解郁丸（人参、柴胡、巴戟天、茯苓、赤芍等）具有培元通滞、益气开郁之功效，能有效改善患者的精神认知和躯体症状[2]，研究其疗效机理有较大的社会意义。

抑郁症为多因素共同致病，一般认为与神经递质改变、血管发生、神经元可塑性及神经再生障碍有关。神经元可塑性包括突触强度改变(递质受体水平的增强、抑制)、突触连接数量改变、神经元构建变化。抑郁症的发生可能是由于神经元做出适当调节的能力和/或构建损害[3,4]。其机制主要涉及5-羟色胺（5-HT）及其受体、核转录因子环磷腺苷反应元件结合蛋白（CREB）等信号分子及其调控。抗抑郁药物可以作用于神经元可塑性的主要调节因子，进而引起神经元可塑性提高，产生抗抑郁作用。前期研究表明，开心解郁丸可调控单胺递质及其受体[5]，本研究进一步观察开心解郁丸对神经元可塑性相关调节因子的影响，以探讨其抗抑郁疗效机理。

1 实验材料

1.1 药物与试剂

开心解郁丸药粉，（中国中医科学院广安门医院大兴制剂室，批号：20140418）。经测定，该药粉含橙皮苷1.524%，柚皮苷、芍药苷、耐斯糖、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、新橙皮苷含量在0.1-0.4%，甘草苷、甘草酸铵、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D含量小于0.1%[6]。阳性对照药盐酸氟西汀（礼来苏州制药有限公司，批号：4139A）。

表1 引物序列

蔗糖、氯仿、异丙醇、无水乙醇（北京化学试剂公司提供）均为分析纯，Trizol试剂，（Life technologies公司，批号：）；FastQuant RT Kit逆转录试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，批号：）；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（美国应用生物公司，批号：）；7900HT型荧光定量PCR仪，美国应用生物公司；高速冷冻离心机，HITACHI公司。

1.2 动物模型

SD大鼠48只，雄性，SPF级，体质量（220±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供（许可证编号：SYXK（京）2012-0001）。采用慢性不可预见性温和应激（CUMS）叠加孤养的方法建立抑郁症模型。CUMS方法改进包括夹尾1 min；禁水24 h；禁食24 h；4℃冰水游泳5 min；45℃环境5 min；明暗颠倒24 h；电击足底5 min；异物放置24 h；潮湿垫料24 h；鼠笼倾斜24 h；水平振荡5 min等刺激。这些刺激每天随机采取一种，使动物不能预料刺激发生，共42 d。除正常组外，CUMS的同时单笼隔离饲养。

1.3 分组及给药

实验前大鼠每笼3-5只正常饲养，适应环境后进行糖水试验，根据糖水消耗百分比随机分为正常组、模型组、开心解郁丸组、盐酸氟西汀组，每组12只。治疗组在抑郁造模的同时开始灌胃给药。开心解郁丸给药剂量0.9 g·kg-1·d-1，采用无菌水将9 g药粉配成100 mL混悬液。盐酸氟西汀给药剂量2.0 g·kg-1·d-1，1片（20 mg）用无菌水配成100 mL混悬液。两者灌胃体积均为1 mL·100 g-1体质量，连续灌胃42 d。

2 实验方法

2.1 糖水偏嗜实验

造模42 d后所有大鼠单笼饲养，配制1%蔗糖溶液，第1天放置2瓶糖水，第2天放置糖水和纯水各1瓶，第3天禁水24 h，第4天给放置糖水和纯水各1瓶并称重，120 min后，取2瓶水再次称重。记录每只大鼠的糖水消耗量、纯水消耗量，计算糖水消耗百分率=糖水消耗量/（糖水消耗量+纯水消耗量）*100%[7]。

2.2 Morris水迷宫

采用Morris水迷宫法进行大鼠认知功能的测定,方法参见文献[8],记录大鼠逃避潜伏期。

2.3 实时荧光定量PCR（RT-PCR）验证差异表达mRNA

每组随机取10只大鼠左侧额叶皮质，采用RTPCR方法测定糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、5-羟色胺2C受体（HTR2C）、血管内皮生长因子（VEGF）及内参照GAPDH等mRNA。引物序列见表1，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。提取总RNA，RNA反转录后，荧光定量PCR检测，反应条件：95℃ 5 min；95℃30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 35 sec，40 cycles；72℃ 8 min。

2.4 统计学方法

所测数据均以均值±标准差（x±s）表示，采用SPSS16.0统计软件进行分析。多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Games-Howell法进行分析。以P＜0.05为有显著性差异的标准。

3 结果

3.1 糖水偏嗜实验

与正常组比较，模型组大鼠糖水消耗百分比明显降低（P＜0.001）；与模型组比较，开心解郁丸组和盐酸氟西汀组能显著增加抑郁大鼠糖水消耗百分比（P＜0.05），见表2。

3.2 Morris水迷宫试验

与正常组比较，模型组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，开心解郁丸组和盐酸氟西汀组有Morris水迷宫逃避潜伏期的趋势，但没有统计学意义（P＞0.05），见表3。

3.3 RT-PCR验证差异表达mRNA

与正常组比较，模型组大鼠额叶皮层中CREB mRNA表达降低（P＜0.05）；GSK-3β和HTR2C mRNA表达升高，VEGF mRNA表达降低，但无统计学意义。与模型组比较，开心解郁丸和盐酸氟西汀都有降低额叶皮层中GSK-3β和HTR2C mRNA表达的作用（P＜0.05），开心解郁丸可以升高CREB和VEGF mRNA表达的作用（P＜0.01，P＜0.05），见表4。

4 讨论

本研究中阳性药盐酸氟西汀为选择性5-HT再摄取抑制剂（SSRIs），选择性抑制神经元突触前膜对5-HT的再摄取，使突触间隙5-HT含量升高，但对多巴胺（DA）受体、M胆碱受体及H1组胺受体无影响。开心解郁丸调节单胺递质的作用较盐酸氟西汀更广泛，可不同程度地增加脑内5-HT、去甲肾上腺素（NA）、DA的水平[7]，与细胞膜上的单胺递质受体结合来激活cAMP-CREB通路。5-HT2C受体（HTR2C）是其中的一种单胺递质受体，HTR2C阻断可能是SSRIs类治疗抑郁症的重要原因之一。

CREB是一种重要的核转录因子，它在神经元功能和结构可塑性的调节中起重要的作用，是多条与抑郁症相关的信号通路调节的交汇点，是抗抑郁药物治疗的重要靶点之一。GSK-3β具有调节CREB信号的作用，抑制GSK-3β会引起磷酸化CREB的显著升高[9]。GSK-3β具有调节神经生长与神经可塑性的作用，应激刺激可增加小鼠海马齿状回GSK-3β的表达[10]。

CREB通过磷酸化激活调节下游基因转录进而发挥生物学效应。其中，CREB与VEGF受体的启动子区域结合[11]，从而发挥调节神经元可塑性的作用。VEGF能够特异作用于内皮细胞，促进内皮细胞的增殖分化，促进血管的生长，有助于神经元轴突的生长和存活，刺激胶质细胞增殖，对神经和血管具有营养和保护双重作用的VEGF受到了进一步的关注。VEGF已被认为是血管系统和神经系统相伴发生的一个重要的共有因子[12]。

表2 糖水偏嗜实验中糖水消耗百分比（x±s，n=12）

表3 Morris水迷宫逃避潜伏期（x±s，n=12）

表4 RT-PCR验证差异表达mRNA（x±s，n=10）

前期研究表明，开心解郁方能明显提高抑郁大鼠脑皮质中5-HT、NE、DA和高香草酸（DA代谢产物）含量，上调海马中5-HT1A受体mRNA和大脑皮层中5-HT2A受体mRNA水平，同时下调海马中5-HT2A受体mRNA和大脑皮层中5-HT1A受体mRNA水平[5]。本研究发现，开心解郁丸可明显降低GSK-3β和HTR2C mRNA、升高CREB和VEGF mRNA水平。综上，开心解郁丸调节5-羟色胺（5-HT）及其受体，抑制GSK-3β和激活CREB，进一步调节VEGF从而发挥调节神经元可塑性的作用。

开心解郁丸的原处方（开心解郁方）在临床研究中具有改善心情抑郁、兴趣缺乏、乏力、心烦不安、失眠、心悸气短、胸闷、善太息、自汗等症状，能增强颞下回、楔前叶等脑区神经元自发活动，其中颞下回与人的记忆、面部表情相关[13]。该处方中人参、柴胡、远志、石菖蒲、巴戟天等中药均有改善学习记忆的功能。本课题组未公开的研究资料显示，开心解郁丸能显著增加CUMS所致抑郁小鼠跳台潜伏期。但本研究中，采用Morris水迷宫分析开心解郁丸对学习记忆的影响，显示该药没有明显改善学习记忆的功能。该药在学习记 忆方面不一致的结果，有待于进一步评估和确认。

1 张晓南,黄世敬.血管性抑郁症病机证治探讨.环球中医药,2013,6(6)：465-468.

2 张晓南.开心解郁汤治疗血管性抑郁症疗效观察.北京：中国中医科学院.2014.

3 Fuencisla P C,Rebeca V,Alvaro D,et al.Neural Plasticity and Proliferation in the Generation of Antidepressant Effects：Hippocampal Implication.Neural Plast,2013(2)：164-168．

4 周静洋,李丽娜,鲁艺,等.培元解郁方对IFN诱导抑郁模型大鼠海马神经元可塑性的影响.世界中西医结合杂志,2016,11(8)：1083-1086.

5 Huang S J,Zhang X H,Wang Y Y,et al.Effect of Kaixin Jieyu Decoction on the Behavior and Monoamines Neurotransmitter and 5-HT Receptor Subtypes Expression in the Brain of Rats with Depression.Chin J Integr Med,2014,20(4)：280-285.

6 Pan J H,Lei X M,Wang J L,et al.Effects of Kaixinjieyu,a Chineseherbal medicine preparation,on neurovascular unit dysfunction in rats with vascular depression.BMC Complement Altern Med,2015,15：291.

7 潘菊华,王彦云,李多娇,等.开心解郁丸对血管性抑郁大鼠单胺递质及BDNF的影响.中成药,2017,39(6)：1139-1144.

8 Ueno Y,Zhang N,Miyamoto N,et al.Edaravone attenuates white matter lesions through endothelial protection in a rat chronic hypoperfusion model.Neuroscience,2009,162(2)：317-327.

9 Hoeke A B,Lilian H M,Lonneke J H,et al.Glycogen synthase kinase-3(GSK-3)regulates TGF-β1-induced differentiation of pulmonary fibroblasts.Br J Pharmacol,2013,169(3)：590-603.

10 Shapira M,Licht A,Milman A,et al.Role of glycogen synthase kinase-3beta in early depressive behavior induced by mild traumatic brain injury.Mol Cell Neurosci.2007,34(4)：571-577.

11 Jin E,Liu J,Suehiro J,et al.Differential roles for ETS,CREB,and EGR binding sites in mediating VEGF receptor 1 expression in vivo.Blood.2009,114：5557-5566.

12 Foumier N M,Duman R S.Role of vascular endothelial growth factor in adult hippocampal neurogenesis：implications for the pathophysiology and treatment of depression.Behav Brain Res,2012,227(2)：440-449.

13 谭赛.开心解郁方治疗血管性抑郁症疗效观察及其fMRI脑功能成像机理探讨.北京：中国中医科学院.2016.

Effects of Kai-Xin Jie-Yu Pill on Neural Plasticity in Rats with Depression

Pan Juhua,Wang Yanyun,Li Duojiao,Chen Yuxia,Chen Zhao,Zhang Ying,Huang Shijing
(Guang′anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China)

This article was aimed to investigate the function and mechanism ofKai-Xin Jie-Yu(KXJY)pill on depression.The depression model rats were established by chronic unpredictable mild stress and separation.The sucrose preference test and Morris water maze(MWM)were performed.The regulation effects of neural plasticity-related genes including glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β),cAMP-response element binding protein(CREB),5-hydroxytryptamine 2C receptors(HTR2C),and vascular endothelial growth factor(VEGF)were determined.The results showed that among depression model rats,KXJY pill significantly increased the sucrose preference and the escape latency of MWM in a certain extent.The neural plasticity-related genes including GSK-3βand HTR2C mRNA were decreased significantly,whereas CREB and VEGF mRNA were increased significantly with the treatment of KXJY pill.It was concluded that KXJY pill had the function of reducing depression-like behavior,which might be mediated by the regulation of GSK-3β,CREB,HTR2C and VEGF.

Kai-Xin Jie-Yu pill,depression,rat,neural plasticity

10.11842/wst.2017.08.016

R965

A

2017-07-19

修回日期：2017-08-18

＊ 国家自然科学基金项目（81573790）：基于lncRNA-miRNA网络对神经血管单元稳态调控探讨益气开郁中药抗抑郁机制，负责人：黄世敬；北京市科技计划“十病十药”研发专项（Z161100001816013）：开心解郁颗粒治疗血管性抑郁症的成药性研究，负责人：黄世敬；国家自然科学基金项目（81603443）：开心解郁丸通过长链非编码RNA调控JAK-STAT通路治疗血管性抑郁的研究，负责人：潘菊华。

＊＊ 通讯作者：黄世敬，研究员，主要研究方向：中医脑病。

（责任编辑：陈 宁，责任译审：王 晶）