鲜剥大蒜中腐败微生物的分离纯化及鉴定

曹 琳，曹 东，陈存坤，何竹筠，邢亚阁，张广峰*，王宝刚

（1.西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610039；2.国家农产品保鲜工程技术研究中心，天津 300384；3.信阳农林学院 食品学院，河南 信阳 464000）

鲜剥大蒜中腐败微生物的分离纯化及鉴定

曹 琳1，曹 东1，陈存坤2，何竹筠1，邢亚阁1，张广峰1*，王宝刚3

（1.西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610039；2.国家农产品保鲜工程技术研究中心，天津 300384；3.信阳农林学院 食品学院，河南 信阳 464000）

对鲜剥大蒜霉变部分的腐败微生物进行分离纯化，观察待测菌株的菌落形态特征、菌丝显微结构，并进行分子生物学分析。结果表明，经过分离纯化后一共得到4株菌，通过对其菌落形态特征和菌丝显微结构观察，初步判定为青霉、根霉、赤霉及曲霉；通过聚合酶链式反应（PCR）扩增、产物测序和序列分析，最终鉴定4株菌分别为：桔青霉（Penicillium citrinum）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、赤霉（Gibberella intermedia）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）。

鲜剥大蒜；腐败微生物；分离纯化；鉴定

大蒜（garlic）为百合科葱属多年生草本植物，原产于西亚和中亚，张骞出使西域将其带回中国，现在中国的大蒜产量居世界首列。大蒜味辛辣刺激，主要功效成分为大蒜素，具有良好的生物活性、保健作用和药用价值[1-3]。

目前，国内对大蒜的功能性成分、大蒜素的抑菌作用及带皮大蒜的贮藏保鲜研究较多[4-7]，而关于鲜剥大蒜却鲜有研究。由于大蒜表面带有一层薄膜和鳞皮，食用时较难去除，而鲜剥大蒜则可以直接食用或加工，符合现代社会方便、快捷的消费模式。但鲜剥大蒜在贮藏过程中易发生色泽发黄、生根发芽、霉变等品质劣变现象，大大降低经济价值[8-9]。本实验对鲜剥大蒜中的腐败微生物进行分离纯化，通过观察待测菌株的菌落形态、菌丝显微结构，并对其进行了分子生物学分析和鉴定，以期为鲜剥大蒜在贮藏保鲜研究中提供实验菌株和一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大蒜：市售，剥开后在室温条件下放置至发霉；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、马铃薯葡萄糖肉汤（potato dextrose broth，PDB）培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；真菌脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物纯化试剂盒：上海生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；电热恒温隔水式培养箱：黄石市恒丰医疗器械有限公司；尼康E100生物显微镜：上海光学仪器五厂。

1.3 方法

1.3.1 菌种分离纯化

准确称取25 g霉变大蒜，用无菌水冲洗2～3次，在无菌条件下破碎，加入装有225 mL无菌水的锥形瓶中，振荡20 min，混匀备用[10]。将大蒜悬浮液进行10倍梯度稀释，分别吸取不同稀释度的溶液1 mL加入PDA培养基中，用无菌涂布棒涂匀后，放于27℃恒温培养箱中倒置培养3～5 d，每个稀释度做3次重复试验。待平板上长出各种形态菌落后，用接种针挑取不同形态的单菌落分别以平板划线法接种，并做好标记，于27℃培养箱中培养72 h后观察菌落形态，重复以上操作，直至获得纯培养物[11]。将纯化后的菌株制成斜面保存于4℃冰箱中备用。

1.3.2 菌种形态初步鉴定

（1）形态特征观察

将纯化后的菌种接种到PDA培养基上，置于27℃恒温培养箱中培养，每天观察菌落形态特征（菌落生长速度、颜色、质地、表面情况状态），参照文献[12-13]确定病原菌的种类。

（2）显微结构观察

将上述纯化的菌种在恒温培养箱中培养5～7 d，待其长出孢子。用镊子夹取事先浸泡在酒精中的载玻片和盖玻片于酒精灯上轻轻灼烧，去除酒精后放置在无菌操作台上的滤纸片上冷却。在载玻片中央滴加一滴无菌生理盐水，用解剖针从培养霉菌的平板中挑取少许菌丝，依次用体积分数50%的乙醇溶液和蒸馏水快速浸润清洗后，放入滴有无菌生理盐水的载玻片上，并用解剖针小心将菌丝分散，盖上盖玻片，并注意排除气泡，在显微镜下进行微观形态观察[14-15]。

1.3.3 分子生物学鉴定

（1）霉菌DNA提取

待测菌株分别接种于PDA培养基上，27℃培养3～5 d后，用接种环挑取菌丝接种于装有100 mL PDB的锥形瓶中，27℃、150 r/min摇床培养3～5 d后，用无菌滤纸过滤得菌丝，再用无菌水冲洗后待用。将上述菌体加入事先装有100 mg灭菌的石英砂的预冷研钵中，迅速充分研磨，加入蛋白酶K，用3 mL溴化十六烷基三甲铵（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）裂解液将粉末转移至10 mL灭菌离心管中，混合均匀。将离心管放入65℃水浴中保温30min，冷却后加入相同体积的氯仿和异戊醇混合液（混合体积比=24∶1），摇匀后在室温条件下12000r/min离心20min。将上述上清液转移到另一支10mL无菌离心管中，同时加入等体积预冷后的异丙醇，混匀，于-20℃冰箱中静置2～3 h。将上述静置后的离心管4℃、10000r/min条件下离心20min，弃去上清液，用冰冷的体积分数70%的乙醇洗涤沉淀，相同条件下进行离心，重复操作2～3次。弃去上清液，室温条件下晾干DNA，待离心管中沉淀呈透明状后，加入0.2 mL TE（含20 μL/mL核糖核酸酶）溶解DNA，放于37℃水浴30 min除去RNA，于-20℃保藏[16]。

（2）PCR扩增与测序

反应程序：94℃预变性4min，依次循环：94℃变性40s，48℃退火45 s，72℃延伸1 min，总共进行32个循环，之后在72℃延伸10 min，最后在4℃停止反应[17]。PCR反应结果经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检查是否有适当大小的条带。PCR扩增产物测序由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。

（3）产物序列分析

将测得的各菌株序列上传到美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）网站的BLAST上，进行序列比对分析，筛选并下载相似性较高的序列，确定最终菌株种属。

2 结果与分析

2.1 分离纯化结果

通过平板梯度稀释和划线法，从霉变鲜剥大蒜中分离得到4株不同菌落特征的霉菌菌株，通过点值法分离纯化培养后，依次编号为DM1、DM4、DM5和DM6，进行菌落形态鉴定和分子生物学鉴定。

2.2 菌种形态特征观察结果

2.2.1 形态特征观察结果

菌株DM1、DM4、DM5、DM6在PDA培养基上生长的菌落形态特征如图1所示。

图1 菌株DM1（A）、DM4（B）、DM5（C）及DM6（D）在PDA培养基上的菌落形态特征Fig.1 Colony morphological characteristics of strain DM1(A),DM4(B),DM5(C),DM6(D)on PDA medium

由图1A可知，菌株DM1在培养基上的生长速度中等，菌落从中心由白色逐渐变为灰绿色，边缘为一圈白色，随着培养时间的延长，其菌落颜色基本保持不变，菌落表面平坦干燥，质地呈粉状。

由图1B可知，菌株DM4在培养基上的生长速度极快，2～3 d即可长满整个平板，随着培养时间的延长，菌落由白色逐渐变为灰白色，培养14 d后则呈黑褐色，其菌落呈疏松绒毛状，表面干燥。菌落背面开始为白色，后来变为灰白色。

由图1C可知，菌株DM5在培养上的生长速度中等，从培养开始到结束，其菌落颜色一直保持白色，菌落质地为稠密的絮状，菌落表面褶皱，边缘不整齐，呈放射状，并且表面湿润。培养两周以后，菌落背面由白色变为黑褐色，呈放射状。

由图1D可知，菌株DM6在培养上的生长速度缓慢，培养初期，菌落颜色呈现淡黄色，并且菌落直径较小，随着培养时间延长，菌落中心的颜色为浅黄色，菌落边缘为白色，菌落质地为疏松絮状，表面凸起，呈同心环状，边缘整齐，表面干燥。在菌落培养期间，菌落背面始终为浅黄色。

2.2.2 显微观察结果

（1）菌株DM1菌丝形态特征

图2 菌株DM1在显微镜下的菌丝形态特征Fig.2 Mycelial morphology of strain DM1 under microscope

由图2可知，菌株DM1的孢子呈蓝绿色，大部分为圆球形，且其疏松分散，孢子梗顶端无膨大的孢子囊，孢子穗与扫帚形状类似。根据菌株DM1菌落形态特征和菌丝显微结构，通过查阅参考文献[18-19]，其形态特征与青霉类似。

（2）菌株DM4菌丝形态特征

图3 菌株DM4在显微镜下的菌丝形态特征Fig.3 Mycelial morphology of strain DM4 under microscope

由图3可知，菌株DM4具有细长的菌丝，菌丝下端生出假根，其顶端膨大的部分为孢子囊，假根与孢子囊之间为细长的孢子囊梗。假根分枝较多，生长迅速且杂乱无章，表面光滑；孢子囊呈圆形，其颜色逐渐由白色变为黑褐色，其外壁平滑，成熟时半径为80～110 μm；孢子囊梗起初为白色，随培养时间延长，逐渐变为如图所示的黑褐色，其呈细长、无分枝状，表面光滑，无分隔。根据菌株DM4菌落形态特征和菌丝显微结构，通过查阅参考文献[18-19]，其形态特征与根霉类似。

（3）菌株DM5菌丝形态特征

图4 菌株DM5在显微镜下的菌丝形态特征Fig.4 Mycelial morphology of strain DM5 under microscope

由图4可知，菌株DM5的菌丝细长、稠密，并且分枝较多，从主干菌丝逐渐长出分枝菌丝，再继续分枝，看上去杂乱无章，呈现灰白色，外壁粗糙；菌株DM5的孢子呈白色，大多呈球形，数量较少。根据菌株DM5菌落形态特征和菌丝显微结构，通过查阅参考文献[18-19]，其形态特征与赤霉类似。

（4）菌株DM6菌丝形态特征

图5 菌株DM6在显微镜下的菌丝形态特征Fig.5 Mycelial morphology of strain DM6 under microscope

由图5可知，菌株DM6具有细长的菌丝，整体来看与金针菇形状相似。分生孢子梗细长，外壁粗糙，有悬浮毛状物，呈浅黄色；分生孢子梗顶端膨大，呈球形或椭球型，孢子囊中心为环状，环状外侧为疏松绒毛状且外壁粗糙不平。根据菌株DM6菌落形态特征和菌丝显微结构，通过查阅参考文献[18-19]，其形态特征与曲霉类似。

2.3 菌种分子生物学鉴定结果

2.3.1 PCR电泳扩增结果

实验分别扩增了菌株DM1、DM4、DM5和DM6这4株霉菌的内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列，采用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，其PCR电泳扩增结果如图6所示。

图6 菌株的PCR电泳扩增结果Fig.6 PCR amplification results of strains

由图6可知，4株霉菌的ITS序列扩增后，所检测出的条带均无杂带，并且条带大小大致在500～750 bp长度范围内，符合ITS序列预期的长度，因此可以用于下一步对基因的鉴定。

2.3.2 产物测序与序列分析结果

将测序所得的基因序列通过NCBI网站，提交到GenBank数据库中，进行Blast分析对比，对4株分离霉菌菌株进行鉴定分析，其ITS序列对比鉴定结果如表1所示。

表1 待鉴定霉菌的ITS序列对比鉴定结果Table 1 Identification results of ITS sequence analysis of moulds

由表1可知，将4株待鉴定的霉菌菌株基因序列在GenBank数据库进行了对比分析，其相似度达到了99%。因此，分离霉菌DM1、DM4、DM5和DM6分别被鉴定为桔青霉（Penicillium citrinum）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、赤霉（Gibberellaintermedia）、赭曲霉（Aspergillusochraceus）。将这4株霉菌的纯培养物分别做成菌种斜面后，在四川省微生物资源平台菌种保藏中心进行系统保藏，其注册保藏编号分别为SICC3.977、SICC3.978、SICC3.976、SICC3.975。

3 结论

本研究分离纯化了霉变大蒜中的霉菌，通过对待鉴定的霉菌菌株进行形态特征描述、菌丝显微镜特征观察和分子生物学分析，得到4株待测霉菌的准确鉴定结果分别为桔青霉（Penicillium citrinum）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、赤霉（Gibberella intermedia）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）。为后续鲜剥大蒜的腐败原因研究提供实验菌种以及贮藏保鲜提供一定的参考。

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Isolation,purification and identification of spoilage microorganisms in fresh garlic

CAO Lin1,CAO Dong1,CHEN Cunkun2,HE Zhujun1,XING Yage1,ZHANG Guangfeng1*,WANG Baogang3
(1.School of Food and Biotechnology,Xihua University,Chengdu 610039,China;2.National Engineering Technology Research Center For Preservation of Agriculture Product,Tianjin 300384,China;3.Xinyang College of Agriculture and Forestry,Xinyang 464000,China)

Spoilage microorganisms derived from the moldy part of fresh garlic were isolated and purified,and the morphological characters,the mycelial microstructure and molecular biological analysis of the strains were analyzed.The results indicated that there were 4 strains screened after isolation and purification,and they were preliminarily identified asPenicillium,Rhizopus,GibberellaandAspergillusby observing the morphological characters and mycelial microstructure.After PCR amplification,product sequencing and sequence analysis,the strains were identified asPenicillium citrinum,Rhizopus stolonifer,Gibberella intermediaandAspergillus ochraceus.

fresh garlic;spoilage microorganisms;isolation and purification;identification

TS201.3

0254-5071（2017）09-0123-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.027

2017-06-16

四川省科技厅科技扶贫项目（2017NFP0047）

曹 琳（1994-），女，硕士研究生，研究方向为果蔬保鲜与加工。

*通讯作者：张广峰（1985-），男，讲师，硕士，研究方向为食品加工。