糖化过程降低啤酒反-2-壬烯醛的工艺优化研究

吕慧威，丁元菲，蔡 勇，赵琳琳，王艳丹*

（1.吉林师范大学 博达学院，吉林 四平 136000；2.四平金士百纯生啤酒有限公司，吉林 四平 136001；3.长春职业技术学院 食品生物技术分院，吉林 长春 130033）

糖化过程降低啤酒反-2-壬烯醛的工艺优化研究

吕慧威1，丁元菲2，蔡 勇3，赵琳琳1，王艳丹1*

（1.吉林师范大学 博达学院，吉林 四平 136000；2.四平金士百纯生啤酒有限公司，吉林 四平 136001；3.长春职业技术学院 食品生物技术分院，吉林 长春 130033）

为了研究啤酒生产中麦芽脂肪氧化酶活力、大米脂肪酸含量和麦汁回旋沉淀时间对啤酒老化程度的影响，采用固相微萃取-气质联用法(SPME-GC-MS)，对不同麦芽脂肪氧化酶活力和大米脂肪酸含量的麦汁中反-2-壬烯醛前体物质（T2N-P）及硫代巴比妥酸（TBA）值进行了比较分析，并将二者与回旋沉淀时间进行了正交试验。结果表明：三个品种麦芽的脂肪氧化酶活力与麦汁T2N-P和TBA值呈显著正相关（P＜0.01），相关系数R2≥0.995，随着大米脂肪酸含量的增加，T2N-P和TBA值也都有不同程度的增加，正交试验结果显示，麦芽脂肪氧化酶活力是影响T2N-P最重要的因素，回旋沉淀时间次之，大米脂肪酸含量影响最小。优化后的啤酒T2N-P和TBA值分别降低了23.25%和29.32%，酯香、协调感、综合评分和各批次产品的质量稳定性均较优化前大幅增加。

啤酒老化；脂肪氧化酶活力；大米脂肪酸含量；反-2-壬烯醛前体物质；硫代巴比妥酸值

贮存期啤酒风味长期不变的可能性称之为啤酒的风味稳定性[1]。成品啤酒在贮存过程中，由于受到温度、溶氧以及光氧化等因素影响，啤酒的风味是不断变化的[2]，在失去原有的风味基础上又出现了纸板味、铁腥味等，同时口感会变的粗糙、苦涩，这种现象称之为“啤酒的老化”[3]。

在啤酒的老化机理中被认可的说法是多不饱和脂肪酸被脂肪氧化酶氧化生成羟基过氧化物，进一步反应生成挥发性羰基化合物[4]。在啤酒生产过程中，任何异常因素都可能导致啤酒发生老化、产生老化物质及其前驱体[5]。啤酒的老化过程只能延缓，但绝不可能避免[6]，要想生产出风味稳定性优良、保鲜期长的啤酒，可以通过一定的调控手段来实现[7]，一是啤酒里要有大量的抗氧化性物质，二是在啤酒酿造过程中选用合理的手段和方法，使老化物质及其前驱体的含量减少[8]。

随着研究的不断深入，学者们发现啤酒的老化物质及其前驱体在上游环节可能已经形成，而在贮存过程中老化味才逐渐地表现出来，因此啤酒的生产原料及制麦和糖化工序对啤酒风味稳定性的影响表现的越来越明显[9]。

反-2-壬烯醛（trans-2-nonenal，T2N）是糖化过程脂肪氧化酶（lipoxidase，LOX）参与酶促氧化反应的最终代谢产物[10]，是一种能够导致啤酒老化的典型的醛类物质，曾被誉为啤酒老化的“指示剂”[11-12]，可以作为原料新鲜度的重要指标[13]。之前的研究主要集中在通过改进工艺降低T2N含量，但T2N的含量并不能绝对代表啤酒的抗氧化能力，原因是啤酒的老化往往是在后期贮藏过程中表现出来的，即使前期含量很低，但可能由于生产工艺控制不当或贮藏条件不适导致前期糖化过程产生的反-2-壬烯醛前体物质（trans-2-nonenal precursor，T2N-P）在贮藏一段时间后大量转化为T2N，大大增加啤酒老化的潜在隐患，因此，在糖化过程中减少T2N及其T2N-P的生成量尤为重要[14]。

本研究将以T2N-P、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值作为评价指标，采用固相微萃取-气质联用（solidphase microextractoin-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC/MS）法对不同麦芽LOX活力和大米脂肪酸含量的麦汁反-2壬烯醛前体物质（T2N-P）及TBA值进行了比较分析，并将二者与回旋沉淀时间进行了正交试验，分析各因素对T2N-P、TBA值的影响，并找出各影响因素中老化物质含量最优的条件，以期为提高啤酒抗老化能力而进行的糖化工艺优化提供一定的数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

加拿大麦芽、澳洲麦芽和国产麦芽：某麦芽集团有限公司提供；啤酒专用大米：某米业集团有限公司提供。

反-2-壬烯醛标准样品（色谱纯）、硫代巴比妥酸（TBA）、亚油酸：美国Sigma公司；百里香酚蓝指示液：天津鼎盛鑫化工有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4、无水乙醇、硼酸、吐温-20（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；高纯二氧化碳（纯度≥99.5%）：四平金士百纯生啤酒有限公司。

1.2 仪器与设备

Clarus600 GC/MS气相色谱-质谱联用仪（配有电子电离源）：美国PE公司；UGC-12MF氮吹仪：北京优晟联合科技有限公司；配有75 μm CAR-PDMS萃取头的固相微萃取（SPME）装置：美国Sigma公司；UV-1800型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；BGT-6A糖化仪：杭州博日科技有限公司；0.2 mm麦芽圆盘粉碎机：德国Buhler公司；JZSG-II型稻米脂肪酸值仪：上海银泽仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麦汁和啤酒T2N-P检测方法[15]

样品前处理方法：取5 mL待测样品于顶空瓶中，加入足量NaCl，排净空气后压盖密封，油浴120 min，50℃恒温水浴中萃取90 min，待检测。

GC条件：HP-5MS毛细管色谱柱（40m×0.32mm×0.25μm）；氦气（纯度为99.999）；流速1 mL/min；升温程序：初温60℃，3℃/min升至100℃，以10℃/min升至250℃，保持7 min，以10℃/min升至290℃，保持5 min；进样口温度280℃。

MS条件：电离方式采用电子电离（electctronionization，EI）源，电离电压70 eV，离子源温度250℃，传输线温度250℃，测定模式为选择离子监测（selected ion monitoring，SIR），溶剂延迟3 min，全扫描核质比范围29～300 amu。

1.3.2 麦汁和啤酒TBA值检测方法[16]

取待测样品于4℃低温条件下10 000 r/min离心5 min；取上清液10 mL与4 mL TBA试剂混合均匀，60℃水浴中精确加热60 min，迅速冷却至20℃，于波长530 nm条件下测定其吸光度值，吸光度值即为麦汁或啤酒的TBA值；用超纯水作空白。

1.3.3 麦芽LOX活力检测方法[17]

酶液的提取：称量20g麦芽粉，加入200mL含有NaCl的0.1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH 5.0），用糖化仪40℃搅拌提取1 h，过滤备用。

底物的制备：在500 μL 0.05 mol/L硼酸盐缓冲溶液（pH 9.0）中依次加入250μL吐温-20、25 μL亚油酸、65 μL的1mol/LNaOH，冰水浴超声至澄清，用蒸馏水定容至1mL。

酶活力的测定：在比色杯中加入磷酸盐缓冲溶液2 850 μL、底物50 μL、酶提取液100 μL，于波长234 nm处测量样品1 min和4 min的吸光度值。LOX活力计算公式如下：

式中：X为LOX活力，U/g；A4min为波长234 nm条件下反应4min时的吸光度值；A1min为波长234 nm条件下反应1 min时的吸光度值；M为麦芽的水分含量，%；B为麦芽的酶液体积，μL。

1.3.4 光度滴定法测定大米脂肪酸值[18]

取大米粉10 g于锥形瓶中，加入50.0 mL无水乙醇，200次/min频率振摇10 min，静置1～2 min后过滤至比色管中待测。移取25.0 mL滤液，加入25.0 mL 0.02 g/L百里香酚蓝指示液并至于测量池中滴定，当“终点”指示灯亮时记下所耗用的0.01 moI/L氢氧化钾-95%乙醇标准滴定溶液体积（V1），用无水乙醇作空白（V0），计算100 g干物质试样中游离脂肪酸所需氢氧化钾毫克数。

大米脂肪酸值（以中和100 g干物质试样中游离脂肪酸所需氢氧化钾毫克数表示）的计算公式如下：

式中：Y为大米脂肪酸值，mg/100 g；V1为滴定所耗氢氧化钾标准储备液体积，mL；V0为空白试验所耗氢氧化钾标准溶液体积，mL；C为氢氧化钾标准溶液的浓度，mol/L；56.1为氢氧化钾摩尔质量，g/mol；50为提取试样所用无水乙醇的体积，mL；25为用于滴定的滤液体积，mL；100为换算为100 g干试样的质量，g；m为试样的质量，g；ω为试样水分含量，%。

1.3.5 大生产中麦汁T2N-P的各影响因素正交试验

根据单因素试验结果，以麦芽LOX活力（A）、大米脂肪酸含量（B）和回旋沉淀时间（C）为影响因素，以T2N-P含量为评价指标，进行3因素3水平L9（33）正交试验，根据分析结果得出降低麦汁T2N-P含量的最佳工艺条件，正交试验因素与水平见表1。

表1 降低麦汁T2N-P含量生产工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for process optimization for reduction of T2N-P content

1.3.6 数据统计分析

每组试验均做3个平行，并用SPSS 20.0分析软件对数据进行方差分析。

1.3.7 感官品评[19]

选择7名经过培训且有资质的品酒员，对优化前后的6批成品酒进行盲品。

感官评价标准：每位品酒员都要对每个样品的水果香-酯香、酒花香、青苹果味、醇香、酵母味、硫味、日光臭、焦糖味、酸味、苦味、后苦味、涩味、杀口力、骨架感、协调感、高级醇、双乙酰味、金属味、氧化味、综合评分等20项指标进行评分，并绘制雷达图分析。

2 结果与分析

2.1 不同糖化因素麦汁老化物质比较

2.1.1 不同大米脂肪酸含量的大米制得的麦汁T2N-P和TBA值的比较

从储存的样品中选取3批脂肪酸含量差别较大的大米样品作为试验对象，按照麦芽70%、大米30%的投料比例糖化制得麦汁，检测其TBA值和T2N-P含量，结果见图1。由图1可知，随着大米脂肪酸含量的增加，T2N-P含量和TBA值都有不同程度的增加，其中T2N-P含量的曲线变化最明显，说明脂肪酸含量对其影响最大，因为T2N是脂类氧化的产物，脂肪酸含量越高，氧化反应越剧烈，这也是T2N常被视为是原料新鲜度指示剂的原因。

图1 不同大米脂肪酸含量的麦汁T2N-P含量及TBA值Fig.1 T2N-P contents and TBA value in wort with different fatty acid contents in rice

2.1.2 不同LOX活力麦芽制得的麦汁T2N-P和TBA值的比较

选出LOX活力梯度较大的代表性样品制成协定麦汁，检测其TBA值和T2N-P含量，结果见图2。由图2可知，无论哪个麦芽品种的LOX活力都与对应的协定麦汁的T2N-P含量和TBA值呈显著正相关，绘制散点图的趋势线的相关系数R2均＞0.99。采用SPSS软件分析得出各麦芽的LOX活力与两种老化物质的相关系数R2≥0.995，呈显著正相关（P＜0.01）。说明随着麦芽LOX活力的提高，啤酒的老化程度越高，新鲜度越差。因此，为了避免由此导致的老化加剧，应尽量选择低LOX活力的麦芽以增强啤酒的抗老化能力，也可得出麦芽LOX活力间接影响着啤酒新鲜度，可预测对啤酒新鲜度影响。

图2 不同脂肪氧化酶活力的麦汁T2N-P含量及TBA值Fig.2 T2N-P contents and TBA value in wort with different lipoxidase activity

2.1.3 大生产中麦汁T2N-P的各影响因素正交试验结果

根据单因素试验结果，以麦芽LOX活力、大米脂肪酸含量和回旋沉淀时间为影响因素，以T2N-P为评价指标，进行3因素3水平L9（33）正交试验，通过正交试验来进行优化，根据分析结果找降低麦汁T2N-P的最佳工艺条件，正交试验结果与分析见表2。

表2 降低麦汁T2N-P含量生产工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for process optimization to reduce T2N-P contents in wort

由表2可知，麦芽LOX活力是影响麦汁T2N-P含量最重要的因素，回旋沉淀时间为麦汁T2N-P含量的第二影响因素，大米脂肪酸含量的影响稍低于回旋沉淀时间。分析原因可能是大米在大生产的投料过程中仅占原辅料总量的30%，因此影响效果相对较低。综合来看，使麦汁T2N-P含量最低的生产工艺是A1B2C1，即麦芽LOX活力和大米脂肪酸含量分别为4.415 U/g和50.46 mg/100 g，回旋沉淀时间选择20 min。

2.2 优化前后麦汁T2N-P和TBA值的比较

2.2.1 大生产工艺优化前后麦汁T2N-P和TBA值的比较

选择同一品种的啤酒作为试验样品，编号1#～3#为优化前随机抽取的样品，4#～6#为优化后工艺生产的样品，分别检测了两种工艺条件下的麦汁T2N-P含量和TBA值，结果见图3。由图3可知，采用优化后的工艺生产的麦汁，T2N-P含量和TBA值的平均值分别降低了22.97%和23.66%，而且分析多批麦汁的检测结果发现，不同批次麦汁的T2N-P含量和TBA值检测结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）也分别由8.48%和8.76%降至5.59%和4.12%，优化后的较之前有很大幅度的降低，说明优化后工艺可使麦汁的T2N-P和TBA值大幅降低，并使各批次结果的波动明显减小，充分保证了产品质量的稳定性。

图3 麦汁T2N-P含量和TBA值在工艺优化前后的比较Fig.3 Comparison of T2N-P contents and TBA value in wort before and after optimization

2.2.2 大生产工艺优化前后啤酒T2N-P和TBA值的比较

选择同一品种的啤酒作为试验样品，编号1#～3#为优化前随机抽取的样品，4#～6#为优化后工艺生产的样品，分别检测了两种工艺下啤酒的T2N-P含量和TBA值，结果见图4。由图4可知，两种工艺生产的成品啤酒的T2N-P含量和TBA值的变化与对应麦汁的结果非常接近，也是T2N-P含量和TBA值平均值分别降低了23.25%和29.32%，同样，不同批啤酒的T2N-P和TBA值检测结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）也有很大幅度的降低，说明优化后工艺通过降低麦汁的T2N-P和TBA值而使啤酒的老化物质大幅降低，也使各批次的波动明显减小。

图4 啤酒T2N-P含量和TBA值在工艺优化前后的比较Fig.4 Comparison of T2N-P contents and TBA value in beer before and after optimization

2.2.3 大生产工艺优化前后啤酒感官品评结果分析

由图5可知，工艺优化前后变化较大的有水果香-酯香、酒花香、青苹果味、协调感和综合评分，其中前四项优化后均较原始工艺的值大幅增加，分别增加了118.75%、38.89%、92.31%和68.00%，而氧化味在优化后已经到达了品评阈值以下，醇香、焦糖味、酸味、苦味、杀口力、骨架感等值没有明显变化，其余的酵母味、日光臭等异味在优化前后均未品出。分析水果香-酯香和酒花香等成分经优化后大幅增加的原因，优化后老化物质含量降低，氧化味消失，酯香明显表现出来，致使协调感增加，这也是优化后品评人员认为综合评分较高的主要原因。

图5 啤酒不同生产工艺感官品评比较雷达图Fig.5 Radar chart of sensory evaluation of beer with different production process

3 结论

本研究通过比较不同麦芽LOX活力的麦汁反-2壬烯醛前体物质及TBA值发现，无论哪个麦芽品种的LOX活力都与对应的协定麦汁的T2N-P含量和TBA值的相关系数R2≥0.995，呈显著正相关（P＜0.01）；比较不同大米脂肪酸含量的麦汁T2N-P含量和TBA值发现，随着大米脂肪酸含量的增加，T2N-P含量和TBA值都有不同程度的增加。

通过麦芽LOX活力、大米脂肪酸含量和回旋沉淀时间的正交试验发现，麦芽LOX活力是影响麦汁T2N-P含量最重要的因素，回旋沉淀时间次之，大米脂肪酸影响最小。

将优化前后工艺对比发现，优化后工艺生产的麦汁T2N-P含量和TBA值的平均值分别降低了22.97%和23.66%，啤酒T2N-P含量和TBA值分别降低了23.25%和29.32%，酯香、协调感、综合评分和各批次产品的质量稳定性均较优化前大幅增加。

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Optimization of saccharification process for reduction of trans-2-nonenal in beer

LYU Huiwei1,DING Yuanfei2,CAI Yong3,ZHAO Linlin1,WANG Yandan1*
(1.BODA College of Jilin Normal University,Siping 136000,China;2.Siping Ginsber Draft Beer Co.,Ltd.,Siping 136001,China;3.School of Food Production Technology and Biotechnology,Changchun Vocational Institute of Technology,Changchun 130033,China)

To study the effect of lipoxidase activity,fatty acid content in rice,wort whirlpool precipitation time on beer aging,the trans-2-nonenal precursor(T2N-P)and thiobarbituric acid(TBA)content of wort with different lipoxidase activity and rice fatty acid contents was determined by SPME-GC-MS and analyzed.Then three factors orthogonal experiments were carried out using T2N-P,TBA content and whirlpool precipitation time as evaluation factors.The results showed that lipoxidase activity of three malt varieties,T2N-P and TBA in wort were significantly positive related(P＜0.01),and the correlation coefficientR2was higher than 0.995.With the increase of fatty acid content in rice,T2N-P and TBA also increased in different degree.The orthogonal tests showed that:lipoxidase activity in malt was the most important factor affecting T2N-P,and then was whirlpool time,fatty acids contents in rice was the minimal affecting factors.After optimization,T2N-P and TBA reduced by 23.25%and 29.32%,respectively;Ester aroma,sense of harmony,comprehensive evaluation and the quality stability of each batch were greatly increased.

beer aging;lipoxidase activity;fatty acid contents in rice;trans-2-nonenal precursor;thiobarbituric acid value

TS262.5

0254-5071（2017）09-0107-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.023

2017-07-14

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（2015585）

吕慧威（1982-），女，讲师，硕士，研究方向为酿造酒工艺和食品营养学。

*通讯作者：王艳丹（1988-），女，助教，硕士，研究方向微生物发酵与代谢调控。