基于水溶性共轭聚合物荧光增强测定精氨酸

鲁瑞梅， 肖 毅， 李佳慧， 李 莎， 黄红梅*， 胡玉琴， 张友玉， 何晓晓

(1.湖南师范大学化学化工学院，化学生物学及中药分析教育部重点实验室，湖南长沙 410081；2.玉溪市质量技术监督综合检测中心，云南玉溪 653100；3.湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南长沙 410082)

精氨酸(Arginine，Arg)是组成生物体蛋白质和酶的基本单元之一，它具有调节血糖、增强人体免疫力、延缓衰老和促进伤口愈合等作用，在蛋白质化学、生物化学、食品科学、临床医学和医药工业等方面具有广泛用途[1 - 3]。目前文献报道的Arg检测方法中应用较多的有高效液相色谱法[4]、比色法[5]、极谱法[6]、质谱法[7]、化学发光法[8]、荷移分光光度法[2]和荧光光谱法[9]等。

水溶性共轭聚合物具有共轭聚合物的光电性质，如摩尔吸光系数大、荧光量子产率高以及荧光信号放大效应等和水溶性。作为一种新型的传感材料，水溶性共轭聚合物已被成功用于小分子、金属离子以及DNA等生物大分子的灵敏检测[10 - 12]。本文以水溶性共轭聚合物P1为荧光探针，实现了免衍生化、直接、快速检测Arg，为简便、快捷、高灵敏和特异性地检测氨基酸提供了新的思路和方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

图1 P1,P2,P3和PPESO3的结构示意图Fig.1 The structures of P1,P2,P3 and PPESO3

F-4500荧光光谱仪(日本，Hitachi公司)；DMX 500核磁共振仪(瑞士，Bruker公司)。

水溶性共轭聚合物P1、P2和P3(图1)由本实验室合成[13-14]，PPESO3参考文献方法[15]合成。其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

P1、P2、P3、PPESO3分别用超纯水配制成1.0×10-5mol/L的溶液(以重复单元计算)，Arg储备液浓度为1.0×10-3mol/L；在4.0 mL的共轭聚合物溶液中加入不同量的Arg储备液(不超过20 μL)，混合均匀，稳定5 min后测其荧光光谱和荧光各向异性。

本文采用单通道法测量荧光各向异性值[16]。在最大激发和发射峰下测量IVV、IVH、IHH和IHV，然后根据公式(1)计算相应的荧光各向异性值(激发与发射狭缝均为5 nm，所得荧光各向异性值为3次测量所得的平均值)。

(1)

其中，r为测量的荧光各向异性值；G为仪器的校正因子；IVV、IVH分别为垂直偏振光激发下的垂直、水平偏振的发光强度；IHV、IHH分别为水平偏振光激发下的垂直、水平偏振的发光强度。

2 结果与讨论

2.1 精氨酸对P1荧光光谱的影响

图2为Arg浓度对共轭聚合物P1荧光光谱的影响。由图可知，随着Arg浓度的增加，P1的荧光显著增强(曲线b～n)，整个滴定过程中，P1的荧光最大可以增强近5倍。由图3可知，加入精氨酸的浓度在6.0×10-8～3.06×10-6mol/L和3.06×10-6～7.11×10-5mol/L范围时，Arg浓度与P1荧光增强程度呈良好的线性关系，Arg检出限可达2.0×10-8mol/L。

图2 加入不同浓度Arg时P1的荧光光谱Fig.2 Fluorescence spectra of P1 in the presence of different concentrations of ArgcArg(a-n):0,0.02,0.06,0.46,1.06,3.06,5.06,7.06,11.1,21.1,31.1,51.1,71.1,151(×10-6 mol/L).

图3 Arg浓度与P1荧光增强的关系Fig.3 Relationship between Arg concentration and fluorescence enhancement of P1I and I0 are the fluorescence intensity with and without Arg.

图4 不同浓度的Arg对P1、P2、P3与PPESO3荧光增强的影响Fig.4 Fluorescence enhancement of P1(λex/λem=435/529),P2(λex/λem=375/475),P3(λex/λem=412/509) and PPESO3(λex/λem=441/540) in the presence of various concentrations of Arg I and I0 are the fluorescence intensity with and without Arg.

2.2 共轭聚合物的不同结构对精氨酸响应特性的影响

实验比较了Arg对几种不同结构共轭聚合物荧光增强的影响，见图4。可以看出，P1的荧光增强效果最为显著，P2、P3的荧光增强程度次之，而不含吡啶环的PPESO3的荧光基本没有变化，其相应的荧光增强顺序为P1≫P2>P3>PPESO3。这可能是由于Arg中的胍基能在很宽的pH范围(0～9.0)内保持正电性，因此共轭聚合物吡啶环上氮原子含有的孤对电子可以与带有很强正电性的Arg发生相互作用[17]。而且间位取代的含吡啶环共轭聚合物P1的荧光增强远远高于呈线性、对位取代的含吡啶环共轭聚合物P3，这可能是由于吡啶环非线性连接有利于打破共轭聚合物主链结构的刚性从而具有一定的柔顺性。当P1与Arg发生相互作用时，P1的团聚结构能有效地分散开来，导致P1的荧光更显著地增强。与P1相比，P2引入的间位吡啶环含量过大，其分子量和量子产率将受到很大的影响[18]，因而荧光增强效果也不及P1。

2.3 作用机理探讨

为了进一步探讨P1与Arg的作用机理，我们考察了加入不同浓度Arg后P1体系的荧光各向异性值(图5)。加入Arg，P1的荧光各向异性值降低，这说明Arg的加入使团聚的P1分散开来，从而表现出荧光增强的信号[11]。而其它3种共轭聚合物P2、P3、PPESO3在加入Arg后各向异性值变化不大。因此，荧光各向异性的检测结果证实了P1主链中适当吡啶环的存在是Arg灵敏检测的关键，而且间位取代的吡啶环改善了P1的柔顺性，可以使P1的团聚状态得到有效调控，从而表现出荧光显著增强。

Arg是含有胍基结构的强碱性氨基酸，等电点pI=10.76，在酸性或中性条件下带净正电荷[17]。为了考察Arg分子结构对P1荧光增强的影响，我们同时考察了含有胍基结构的胍基丙酸(Guanidinopropionic Acid，GPA)与P1的作用。如图6所示，Arg使P1的荧光显著增强，而GPA基本上不会引起P1的荧光变化。由于在中性条件下GPA所含净电荷为零[19]，因而Arg与GPA对P1荧光增强影响的区别主要是由于所带电荷不同而导致的静电作用差异引起的。

图5 P1在不同浓度精氨酸下的荧光各向异性值Fig.5 The fluorescence anisotropy of P1 in the presence of various concentrations of ArgcArg(a-e):0,5.5,35.5,75.5,115.5 μmol/L.

图6 P1加入精氨酸和胍基丙酸的荧光响应Fig.6 The increasing efficiency of P1 in the presence of Arg and GPAcArg=10 μmol/L,cGPA=10 μmol/L.

图7 各种氨基酸(10 μmol/L)对P1(10 μmol/L)荧光增强的影响Fig.7 Effect of various amino acids(10 μmol/L) on the fluorescence enhancement of P1

2.4 选择性的考察

为考察该荧光传感方法的特异性，选取了19种水溶性氨基酸进行对照实验，结果如图7所示。只有Arg对P1有明显的荧光增强效果。这一结果表明Arg的特定结构能更有效地改变P1的团聚构型从而使P1的荧光显著增强，因此保证了该方法高的选择性。

2.5 实际样品的测定

为了考察该荧光检测方法的实用性，准确移取盐酸精氨酸注射液(上海信谊金朱药业有限公司，标示量为5 g/20mL) 1 mL转移至250 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。准确吸取10 mL已稀释的注射液转移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀后供测试用。样品测试结果见表1。由表1可知，应用共轭聚合物P1为荧光探针测定注射液中精氨酸含量时其回收率为97.0%～103.5%，相对标准偏差(RSD)小于5%，说明该方法可用于实际样品测定。

表1 样品测定结果(n=3)

3 结论

基于水溶性共轭聚合物P1与Arg特征性的静电作用，建立了一种荧光增强型、免衍生化、直接、快速检测Arg的新方法。该方法简便、快捷、灵敏度高、选择性好，在精氨酸的检测方面具有良好应用前景。