核-壳型赤藓红分子印迹聚合物的制备 及吸附性能的评价

严 恒， 刘静静， 沈正雨， 张 瑞， 胡莹莹， 谢卫红*

(1.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北武汉 430073; 2.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉 430068)

人工合成色素由于其低成本、高稳定性及染色效果较强的特性，已被广泛用作食品工业中的添加剂。然而，人工合成色素的安全性较低，过量的食用会对人体造成伤害，因此我国对食品着色剂有明确的使用标准和限量[1 - 3]。赤藓红属于杂氧蒽类人工合成色素，主要用于果蔬、肉类、调料、糕点、饮料等的着色，其允许添加范围为0.015～0.1 g/kg[4 - 5]。为了保证食品的安全性，严格控制人工合成色素的使用量，精确的色素检测方法是不可或缺的。但是，食品基质成分比较复杂，给准确检测带来一定困难，因此，在色素检测前有效地样品前处理及富集过程是非常必要的[6 - 8]。赤藓红在几种常用的食品着色剂中属于较特殊的一种，对于含有赤藓红食品的前处理方法常用的有两种：一种是国家标准规定的液-液萃取，另一种是固相萃取(如聚酰胺粉固相萃取小柱)。然而，这两种方法都存在一定的弊端，液-液萃取消耗的试剂较大，步骤较繁琐；聚酰胺粉固相萃取吸附材料对于色素的提取依靠的是非特异性作用力，对目标物质的提取缺乏选择性，导致基质中的其它组分同时被萃取出来，影响了对食品中赤藓红的分离富集。因此，需要探究一种新的材料用于赤藓红的选择性分离和富集[9 - 11]。

分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer,MIP)是一种仿抗体材料，能够将目标物质从复杂的样品中选择性吸附出来，已被广泛开发应用于各个领域，包括固相萃取、传感器、酶抑制剂和抗体等[12 - 15]。近年来，许多MIP利用其本身的特性用于其它人工合成色素的检测，并取得了良好的结果[16 - 17]。但是，MIP用于赤藓红的检测文献报道很少。本文采用表面印迹方法，制备核-壳型赤藓红MIP，将其作为吸附材料，利用其高亲和力和选择性能够将赤藓红从复杂的食品基质中提取出来，提高了回收率。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及材料

UV-Lambda 35紫外-可见分光光度计(美国，铂金艾尔默公司)；Nicolet 5700傅里叶红外扫描仪(美国，Nicolet公司)；Ultimate 3000 高效液相色谱仪(美国，赛默飞世尔科技公司)。

二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、赤藓红(Erythrosine)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(分析纯)；4-乙烯基吡啶(4-VP)和聚酰胺粉(Polyamide)购于国药集团化学试剂有限公司(分析纯)；偶氮二异丁腈(AIBN纯度98%)，购于上海源叶生物科技有限公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，纯度98%)购于Sigma-Aldrich贸易有限公司。水为超纯水。

1.2 实验步骤

1.2.1SiO2表面氨基化将10 g SiO2用0.25 mol/L NaOH溶液在室温下搅拌蚀刻30 min，过滤，超纯水洗涤，再加入2 mol/L的HCl 90 ℃回流8 h，过滤，超纯水洗脱至中性，干燥。将处理好的SiO2颗粒分散在5%(V/V)的APTES甲苯溶液中，90 ℃回流12 h，结束后用甲醇除去未反应的APTES，干燥得到表面氨基化修饰的SiO2颗粒。

1.2.2SiO2表面赤藓红分子印迹层的制备在50 mL甲醇∶水=4∶1(V/V)中，加入0.95 mmol功能单体4-VP和0.24 mmol赤藓红，室温下搅拌孵育2 h，然后依次加入1 g氨基化SiO2、4.75 mmol交联剂EGDMA、0.014 g引发剂AIBN，超声混匀，通氮气除氧，70 ℃反应24 h。反应结束后聚合物用含10%氨水的甲醇进行洗脱(索氏提取)，最后再用甲醇洗脱，直至用紫外-可见分析法检测不到模板分子为止。非分子印迹聚合物(Non-imprinted Polymer,NIP)的制备除不加模板外，其它制备过程与MIP一样。

1.2.3动力学吸附实验称取10 mg MIP和NIP各5份于4 mL的离心管内，每个离心管内加入1 mL浓度为600 μg/mL赤藓红水溶液，超声混匀后静置吸附。分别在第5、15、30、45、60 min时用紫外-可见分光光度法测其在533 nm处的吸光值，观察其吸附容量随吸附时间的变化规律。

(1)

其中，Q为吸附容量(μg/mg)；c0为吸附前赤藓红溶液的浓度(μg/mL)；c为吸附后赤藓红溶液的浓度(μg/mL)；V为吸附液体积(mL)；m为聚合物的质量(mg)。

1.2.4等温吸附实验分别称取若干份10 mg赤藓红分子印迹聚合物和非印迹聚合物于4 mL的离心管内，加入不同浓度的赤藓红水溶液，超声混匀后室温下静置吸附。吸附完成后，离心、取上清液，用紫外-可见分光光度仪测定溶液中未被吸附的赤藓红在533 nm处的吸光值。根据吸光值的变化算出赤藓红吸附前后浓度的变化进而得出聚合物的吸附容量。

1.2.5加标回收实验选取“农夫果园果汁”饮料作为实验对象，赤藓红的加标浓度为1、5、10 μg/mL。分别准确称取20 mg MIP和聚酰胺粉各3份于4 mL的离心管内，然后加入2 mL不同浓度的赤藓红果汁溶液，使三份离心管中果汁的色素添加量分别为2、10、20 μg。室温静置吸附20 min后，离心、去除上清。每个离心管内加入2 mL的淋洗液(V水∶V甲酸∶V甲醇=4∶2∶4)，超声洗脱，离心、去除上清；再用10%的氨化甲醇溶液洗脱吸附在MIP和聚酰胺粉上的色素，洗脱液经0.22 μm滤膜过滤后，蒸发至近干，加甲醇复溶，进行高效液相色谱( HPLC)分析。另一种处理方法是MIP和聚酰胺粉吸附色素后，中间省去淋洗步骤，直接用10%的氨化甲醇溶液进行洗脱所吸附的色素，然后进行HPLC分析。

液相色谱条件：Thermo ODS HYPERSIL色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-乙酸铵溶液(pH=4，0.02 mol/L)；梯度洗脱:甲醇：20%～35%，3%/min；35%～98%，9%/min；98%继续6 min；流速:1 mL/min；紫外检测器检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 核-壳型赤藓红分子印迹聚合物的制备及红外表征

2.1.1核-壳型分子印迹聚合物制备为了便于离心分离以及后续固相萃取柱的开发利用，我们将赤藓红的分子印迹聚合物制备在柱层析常用的SiO2柱表面，经过活化的SiO2表面首先硅烷化修饰使SiO2表面带有氨基基团以利于模板分子在SiO2表面的吸附。通过条件优化，分子印迹聚合物层的制备采用4-VP作为功能单体，模板与功能单体的摩尔数比为1∶4，模板的洗脱液以10%氨水的甲醇效果最好。MIP层的制备及重吸附见图1。

图1 核-壳型赤藓红分子印迹聚合物制备路线Fig.1 Synthesis route of core-shell erythrosine molecularly imprinted polymer

图2 NIP(a)、氨基化SiO2(b)和SiO2(c)的红外(IR)光谱图Fig.2 FT-IR spectra of NIP(a),aminated SiO2(b) and SiO2(c)

2.1.2分子印迹聚合物红外表征图2为SiO2、氨基化SiO2及NIP的红外光谱图。对比未氨基化修饰的SiO2，在图中可以看出氨基化SiO2在2 900 cm-1处有C-H键和685 cm-1处有Si-C键的伸缩振动吸收峰，说明硅烷化氨基修饰上去了。对比氨基化SiO2和NIP的红外图谱，发现NIP在1 700 cm-1左右处有交联剂中C=O伸缩振动吸收峰，而氨基化SiO2没有，说明通过聚合反应可以在氨基化SiO2外面包裹了一层聚合物。

2.2 动力学吸附实验

动力学实验的结果如图3所示。由图可知，MIP和NIP在0～15 min时，其吸附容量随着吸附时间的延长迅速增加，当其大于15 min时，吸附曲线趋于平缓，说明在15 min时MIP和NIP达到吸附平衡。NIP的吸附容量小于MIP，这是由于分子印迹聚合物表面的特异性结合位点对靶标物质的特异性识别所产生的。

2.3 等温吸附实验

等温吸附实验的结果如图4所示。由图可知，当赤藓红浓度小于800 μg/mL时，MIP对赤藓红的吸附随赤藓红浓度的增加而增大，当赤藓红浓度大于800 μg/mL时，吸附容量没有太大的变化，则此时吸附趋于饱和。而NIP的等温吸附趋势与MIP相似，但吸附容量小于MIP，这主要是由于印迹聚合物对模板分子的特异性吸附。

图3 MIP和NIP吸附赤藓红的动力学吸附曲线Fig.3 Kinetic adsorption curves of MIP and NIP for erythrosine Erythrosine aqueous solution:600 μg/mL,UV-Vis absorption was detected at λ=533 nm,room temperature.

图4 MIP和NIP对赤藓红的等温吸附曲线Fig.4 Isothermal adsorption curves of MIP and NIP for erythrosine The concentration of erythrosine range from 50 μg/mL to 1 400 μg/mL,UV-Vis absorption was detected at λ=533 nm after 20 min’s adsorption at room temperature.

为了进一步分析印迹聚合物微球对模板分子的结合能力，将Langmuir-Freundlich(LF)模型用于评价分子印迹聚合物的结合特性。其方程式为：

(2)

式中，Q为聚合物微球对于模板分子的平衡吸附容量(μg/mg)，ce为平衡吸附时溶液中游离的模板浓度(μg/mL)，KLF表示结合常数(mL/μg)，Qm为最大表观吸附容量(μg/mg)，n代表结合位点的异质性系数。

Langmuir-Freundlich(LF)等温线无论是对于均质的MIP，还是对于非均质的MIP都有着较为理想的近似拟合效果，从而可以用来比较具有不同分布位点的MIP的结合特性。通过模拟，得出的Qm为48.02 μg/mg，KLF为0.048 mL/μg，n为1.81，R2=0.994。

2.4 加标回收实验

图5为赤藓红加标果汁经MIP和聚酰胺粉提取后的HPLC图，表1和表2分别为经过淋洗和不经过淋洗过程聚酰胺粉和MIP对添加到果汁中赤藓红的回收率。由表1和表2可知，MIP和聚酰胺粉对添加到果汁中低浓度的赤藓红都有一定的吸附，对比实验过程中是否含有淋洗步骤，发现未经过淋洗步骤的MIP回收率高于含有淋洗步骤的回收率，且MIP的回收率较高于聚酰胺粉，在85%以上。以上这些结果表明赤藓红分子印迹聚合物可以用于食品样品中赤藓红的选择性吸附分离，且过程中不需要淋洗步骤，节约了大量的有机溶剂，可以作为一种潜在的固相萃取吸附材料。

图5 淋洗(A、B、C)和非淋洗(D、E、F)条件下赤藓红加标果汁经MIP和聚酰胺粉提取后的液相色谱图Fig.5 Liquid chromatograms of erythrosine spiked juice was extracted by MIP and polyamide under the condition of leaching(A,B,C) and non-leaching(D,E,F) a:erythrosine standard;b:the spiked juice is extracted by MIP;c:the spiked juice is extracted by polyamide.spiked level:2 μg(A,D),10 μg(B,E),20 μg(C,F).peak 1:erythrosine. 表1 有淋洗处理过程的赤藓红的回收率和精确度Table 1 Recovery and precision of erythrosine in the spiked juice with leaching condition

AdsorbentSpiked(μg)Found(μg)Recovery(%)RSD(%)Polyamide2010.5152.5516.44105.0950.9014.7221.0251.002.65MIP208.5142.5522.39103.7537.5029.2120.8241.001.68

表2 无淋洗处理过程的赤藓红的回收率和精确度Table 2 Recovery and precision of erythrosine in the spiked juice without leaching condition

3 结论

采用表面分子印迹技术，以氨基改性的SiO2为内核，赤藓红为模板，4-乙烯基吡啶为功能单体，成功制备了核-壳型色素分子印迹聚合物。该印迹聚合物具有较快的吸附能力，有较好的吸附能力。在实际样品加标实验中，对比聚酰胺粉结果，其回收率较好，且过程中不需要淋洗步骤节约了大量的有机溶剂，可以作为一种潜在的固相萃取吸附材料。