多孔钛表面羟基磷灰石钙磷涂层的制备及生物活性的研究

杨立军， 施 兰， 闫程程， 张 佳， 王 哲， 代文豪， 李宁宁

(陕西科技大学 机电工程学院， 陕西 西安 710021)

多孔钛表面羟基磷灰石钙磷涂层的制备及生物活性的研究

杨立军， 施 兰， 闫程程， 张 佳， 王 哲， 代文豪， 李宁宁

(陕西科技大学 机电工程学院， 陕西 西安 710021)

针对钛及钛合金用于生物医用材料所表现的生物活性不够高的问题，选用多孔钛为基体利用仿生矿化法在其表面制备HA钙磷涂层，得到Ti/HA钙磷涂层复合材料，分析不同表面前处理对涂层形貌的影响,并对涂层的表面形貌、组成和微观结构进行系统分析和表征.再通过模拟体液(SBF)体外浸泡实验对Ti/HA复合材料和多孔钛的生物活性进行研究.结果表明，经前处理后的多孔钛在模拟体液中能诱导羟基磷灰石生成，表现出良好的生物活性.且经沉积液浸泡后的多孔钛的生物活性更高.

多孔钛； 羟基磷灰石； 仿生矿化； 模拟体液； 生物活性

Abstract:In order to solve the problem that the biological activity is not high enough when titanium and titanium alloy used in biomedical materials,The hydroxyapatite calcium phosphate coating was prepared by using biomimetic mineralization on the surface of porous titanium.And analyze the effects of different surface pretreatments on the morphology of the coating and the surface morphology,composition and microstructure of the coating were systematically analyzed and characterized.The bioactivity of Ti / HA composites and porous titanium was investigated by simulating body fluid(SBF)immersion experiments.The results showed that the pre-treated porous titanium could induce the formation of hydroxyapatite in simulated body fluids and showed good biological activity.And the biological activity of the porous titanium after immersion in the sediment is higher.

Keywords:porous titanium; hydroxyapatite; biomimetic method; simulation body fluids; biological activity

0 引言

医用金属材料具有较高的机械强度、硬度及较好的韧性、抗冲击性能，已广泛的应用于人体硬组织修复及替换材料.常用的医用金属材料主要是钛及钛合金材料，其主要特点是密度小、比强度高、耐蚀性好且具有良好的生物相容性.但是，钛及钛合金是生物惰性金属材料，与新生骨之间只能形成机械锁合，两者之间的结合强度较低，会引起植入体松动或自体骨断裂.另外，钛及钛合金与骨的弹性模量不匹配，且其拉伸强度、抗压强度和抗弯强度都比人骨高得多，在应力作用下，将产生不同的应变，出现"应力屏蔽"现象，使得骨组织退化、萎缩，导致植入体的松动和断裂，不能满足长期的使用要求[1].

目前常用的植入体是多孔结构材料，其中多孔钛被认为是最有应用前景的生物医用材料之一.多孔钛及其合金具有开放多孔状结构，使得新骨细胞组织可在植入体内生长及体液传输，且能促进成骨细胞在植入材料表面和孔隙中生长.另外，多孔钛在弹性变形后有一个较长的应力平台，可起到缓冲外来冲击力的作用[2].羟基磷灰石(HA)是脊椎动物硬组织的矿物质成分，具有良好的生物相容性及生物活性，HA种植体能诱导周围骨组织的生长[3-5]，但是它强度低、脆性大，难以植入承重部位作为替代材料.

目前多数研究者在多孔钛及其合金表面通过多种方法制备HA钙磷生物活性涂层，HA涂层的制备工艺主要包括等离子喷涂法、溶胶-凝胶法、离子束辅助沉积技术、电化学沉积法[6]、激光法和仿生法等[7].Oliveira等[8]利用仿生矿化法在种植体表面纳米级的羟基磷灰石涂层中掺入锶，促进成骨和种植体-骨之间形成骨整合的作用.陈建良等[9]采用碱处理法经过预钙化处理后在不同孔隙率的多孔钛样品表面制备了磷灰石涂层.

本文采用不同的前处理方式，利用仿生矿化法在多孔钛表面制备HA钙磷涂层，分析不同表面处理对涂层形貌的影响，并对涂层的表面形貌、组成和微观结构进行系统分析和表征.再通过模拟体液(SBF)体外浸泡实验对Ti/HA复合材料及多孔钛的生物活性进行研究.

1 实验部分

1.1 试样前处理

实验采用的多孔钛最大孔径为30μm，将多孔钛板切割成尺寸规格为10 mm×10 mm×1.5 mm的试样，依次用400号、600号、800号金相砂纸磨光，分别在无水乙醇、蒸馏水中进行超声波清洗.各次清洗加热温度均为20 ℃、超声功率密度40%、清洗时间30 min.在室温下进行干燥，干燥后备用.

切割打磨后的试样在100 mL 18 wt% HCl和100 mL 48 wt% H2SO4混合酸溶液中浸泡30 min，用恒温水浴锅将温度控制在60 ℃，处理完后用去离子水超声波清洗30 min，干燥后试样再分成3组，A3组放入10 mol/L的NaOH溶液处理18 h.清洗干燥后放在饱和的Ca(OH)2溶液中室温浸泡24 h.A4组浸泡在10%的H2O2溶液中处理18 h，再放在饱和的Ca(OH)2溶液中室温浸泡24 h.A5组先放入10 mol/L的NaOH溶液中处理再浸泡在10%的H2O2溶液中处理2 h，用水浴锅将温度控制在60 ℃，之后浸泡在饱和的Ca(OH)2溶液中.试样分组及其前处理方式如表1所示.

表1 试样分组及其前处理方式

1.2 仿生沉积

将HA粉末溶解于0.1 mol/L HCl溶液中，用三羟甲基氨基甲烷和0.1 mol/L的HCl溶液调节溶液pH至7.4，离心处理，得到沉积液.将A3、A4、A5各组样品浸泡沉积液中，首先在4 ℃下恒温浸泡24 h以获得晶种，然后转移至37 ℃下浸泡5天(d)从而获得涂层[10，11]，浸泡完成后，用蒸馏水小心清洗样品表面，真空干燥箱37 ℃恒温干燥12 h.

1.3 体外模拟体液浸泡

为了检测不同前处理方式下多孔钛的生物活性，将前处理的A3、A4、A5组试样及A4组经沉积液浸泡后的样品分别浸泡在标准模拟体液(SBF)中，每两天更换一次SBF溶液，每次SBF的加入量为50 mL，浸泡12 d后取出干燥.

1.4 表面检测

用金相显微镜观察表面形貌，X射线衍射进行涂层物相结构分析，扫描电子显微镜观察涂层表面形貌并用设备自带的能谱分析仪对涂层进行能谱分析，计算钙磷比.

2 结果与讨论

2.1 试样前处理

图1为在100倍的金相显微镜下不同前处理工艺的表面形貌.图1(a)是未经表面处理的多孔钛试样，表面凹凸不平并可以看到不规则的孔隙；图1(b)为金相砂纸打磨后的多孔钛基板，表面呈现清晰的直线状平行的结构，凹坑已明显被磨平，仍能看见微小的孔隙；图1(c)是酸处理后的试样，由图可以看出试样表面出现交错复杂的沟壑状结构；图1(d)是碱溶液处理后的试样，其表面的凹点或沟壑较图1(c)有所平缓，凹坑孔径更小，试样的表面粗糙度更高；图1(e)是H2O2溶液处理后的试样表面形成一层模糊的凝胶状物质；图1(f)为NaOH和H2O2混合处理的的试样，由图可以看出试样表面有少量的凝胶物质，凹点和沟壑平缓，表面相对粗糙.

(a)打磨前 (b)打磨后

(c)酸处理后 (d)碱处理后

(e)H2O2处理后 (f)NaOH和H2O2混合处理后图1 不同前处理工艺的表面形貌

对不同前处理后的多孔钛试样进行了X射线衍射分析.如图2所示，其中曲线1、2、3分别为A4、A3、A5组经过不同前处理后的多孔钛基板XRD衍射图谱，从图2中可以看到明显的钛酸钠峰.比较三组不同前处理方式下的XRD衍射图谱，发现曲线2、3十分相似，说明NaOH和H2O2混合前处理与NaOH溶液前处理的效果相似.

1：A4组；2：A3组；3：A5组图2 前处理后试样的XRD图谱

通过各组试样的表面形貌和XRD衍射图谱，可以看出前处理方式的不同，对基体表面的形貌影响很大，采用硫酸和盐酸配置的混合酸可以使基体表面产生大量的酸蚀凹点或沟槽，增大钛基体的表面粗糙度，同时基体的表面积也增大，为HA的生长提供了更大的空间.碱液处理也会增大钛基体的表面粗糙度，会使钛基体表面产生纳米级微孔[12]，有利于磷灰石的形成.有研究结果表明，粗糙表面较之光滑表面更易于骨基质沉淀和成骨细胞的附着，从而有利于“骨整合”的形成[13].此外，经过碱处理后的钛基体表面会形成多孔钛酸钠结构，含有带负电的Ti-OH基团，有利于HA的形成.在H2O2溶液中，钛表面促进H2O2的分解及钛的氧化，基体表面产生空洞，溶液中产生OH-、OOH-，这些离子吸附到基体表面的氧化钛层上，使基体表面带上-OH或-OOH[14]，可以在钛表面形成一层富含Ti-OH基团的非晶态TiO2，这同碱液处理的效果很接近.Ca(OH)2预钙化液为碱性,其中含有Ca2+和OH-，预钙化过程中这两种离子均可能吸附于基体表面，它们都是HA构晶离子，因此样品经过预钙化后，在沉积液中培养，吸收钙离子更加迅速，有利于HA在钛酸盐的多孔表面上成核长大.

2.2 仿生沉积结果

图3 (a)、(b)、(c)为A3～A5各组试样在37 ℃沉积液中浸泡5 d后的SEM图，可以看出试样表面有少量白色的沉积物，说明多孔钛板在pH为7.4的HA过饱和溶液4 ℃低温浸泡24 h，再经37 ℃恒温浸泡可以在表面制备出HA钙磷涂层.

(a)A3沉积液浸泡5 d (b)A4沉积液浸泡5 d

(c)A5沉积液浸泡5 d图3 各组试样37 ℃沉积液浸泡5 d的SEM图

实验过程中，转入37 ℃恒温箱后，对A3、A4、A5各组样品每隔1 d检测残余沉积液的pH值.表2为4 ℃低温浸泡后转移至37 ℃沉积液浸泡5 d，A3、A4、A5各组沉积液的pH变化数据.图4为37 ℃沉积液浸泡5 d溶液pH值变化曲线，浸泡1 d后A3、A4组的pH值增大，随后又减小，A5组前三天pH呈下降趋势，浸泡4 d的三组试样沉积液的pH值均有回升，之后又是大幅下降.总的来看，沉积液的pH值随时间的增加呈下降趋势，且整个过程中pH处于波动状态，说明沉积过程是一个动态过程.

表2 37 ℃下沉积液的pH值数据

图4 37 ℃下沉积液pH值变化曲线

沉积过程中会发生以下的反应[15，16]：

TiO2+OH-→HTiO3-

(1)

Ti+3OH-→Ti(OH)3++4e-

(2)

Ti(OH)3++e-→TiO2·2H2O+0.5H2↑

(3)

Ti(OH)3++OH-↔Ti(OH)4

(4)

TIO2·nH2O+2OH-↔HTiO3-

(5)

10Ca2++6PO43-+2OH-→Ca10(PO4)6(OH)2↓

(6)

从式(6)可以看出，HA钙磷涂层的沉积反应会消耗沉积溶液中的OH-离子，使得溶液的pH值降低，由于所有的化学反应都是可逆的，若沉积液中OH-离子过度消耗而得不到补充即有可能促使涂层沉积反应逆向进行[17].在这种情况下，涂层就可能发生降解.从图4的曲线图中可以看出，沉积3 d时pH值达到了第一个最小值，3 d后沉积液的pH值开始缓慢升高是因为涂层周围的OH-离子因离子扩散作用的补充量超过消耗量引起的，因此在沉积过程中可以2～3 d之间更换沉积液，使得沉积效果更佳明显.

2.3 模拟体液浸泡实验结果

由前面可知NaOH和H2O2混合前处理与NaOH溶液前处理的效果相似.因此将A3、A4组的试样经过标准SBF溶液12 d培养，干燥后对其表面进行XRD衍射分析，衍射图谱如图5(a)所示.其中，曲线1为A3组的XRD衍射图谱，曲线2为A4组的XRD衍射图谱.对比羟基磷灰石标准XRD衍射PDF图片可知，2θ=26 °、2θ=32 °等均为HA的特征.相比图2中，HA的特征峰很明显，且钛的特征峰部分被覆盖，说明多孔钛表面有羟基磷灰石生成，进而表明几种前处理方式均提高了多孔钛的生物活性.另外，图5(a)、图5(b)中均可以看到钛的氧化物(TiO2，Ti3O5)和氢化物(TiH2).这是因为前期在强碱溶液加热的条件下金属钛电解反应会生成TiH2，碱热处理过程中多孔钛表面会生成金红石型TiO2，Ti3O5则能是由钛的高价氧化物与低价氧化物相互作用生成的[18].

图5(b)为A4组(H2O2前处理)经标准模拟体液培养前后试样的XRD图谱.其中曲线1为沉积液浸泡5 d后试样的XRD衍射图谱，HA的特征峰十分微小，曲线2是A4组试样经过标准SBF溶液培养12 d后的XRD衍射图谱，可以看到在2θ=26 °、2θ=32 °明显的HA特征峰且有钛的氧化物产生，曲线3为沉积液浸泡5 d后再经标准SBF溶液培养12 d后的XRD衍射图谱，图中HA的特征峰比曲线2高，且有磷酸三钙生成，磷酸三钙在人的骨骼中普遍存在，是一种良好的骨修复材料.比较3条曲线可以发现经过沉积浸泡，再用模拟体液培养后的试样表面的Ti特征峰基本完全被覆盖，说明该复合涂层材料具有良好的生物活性.

1：A3 SBF浸泡12 d；2：A4 SBF浸泡12 d (a)A3、A4组SBF浸泡12 d的XRD图谱

1：A4沉积液浸泡5 d； 2：A4 SBF浸泡12 d； 3：A4沉积液浸泡5 d+SBF浸泡12 d (b)A4组沉积液、SBF浸泡的XRD图谱图5 试样的XRD图谱

对不同前处理后在标准模拟体液中浸泡12 d的试样进行扫描电镜观察，如图6(a)、图6(b)、图6(c)所示.其中，图6(a)为A3组标准模拟体液浸泡后试样的SEM图，表面生成了少量的网状磷灰石结构.图6(b)为A4组浸泡后的SEM图，试样表面生成了羟基磷灰石聚集体，还有集聚的盐类结构，由XRD可知该物质为磷酸三钙.由相关文献可知[19,20]，经H2O2处理过的多孔钛表面生成了双相磷酸钙涂层.双相磷酸钙陶瓷是由羟基磷灰石和磷酸三钙两相成分构成的陶瓷.通常其生物活性高于羟基磷灰石陶瓷，其化学组成与骨组织的无机成分相似，且具有良好的生物相容性、生物活性和生物安全性.

图6(c)为A5组标准模拟体液浸泡后试样的SEM图，可以看到少量片状的磷灰石结构.多孔钛与羟基磷灰石涂层复合材料在标准SBF溶液中浸泡12d后，涂层表面被新的HA涂层基本完全覆盖.这表明，Ti/HA钙磷涂层复合材料能够引导磷灰石晶核在其表面形成，而模拟体液为磷灰石的过饱和溶液，磷灰石晶核一旦形成，就可以通过消耗周围溶液中的钙离子和磷离子而自发长大.同时也说明羟基磷灰石与钛的复合材料具有良好的生物活性.

(a)A3组SBF浸泡12 d (b)A4组SBF浸泡12 d

(c)A5组SBF浸泡12 d图6 SBF浸泡12 d后复合试样的SEM图

图7是A3组试样在模拟体液中浸泡12 d后试样表面涂层的EDS能谱，图7中可以看到显着的Ca、P信号，表明试样表面有磷灰石相形成，计算其Ca/P比大约是1.53，这与羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)的化学计量比十分接近，表明该涂层试样具有良好的生物活性.

图7 模拟体液浸泡后表面涂层EDS能谱

3 结论

本文通过仿生矿化法在多孔钛表面制备HA钙磷涂层，分析不同表面处理对涂层形貌的影响并对涂层的表面形貌、组成和微观结构进行系统分析和表征.再通过模拟体液(SBF)体外浸泡实验对Ti/HA复合材料及多孔钛的生物活性进行研究.结果表明，通过初始pH为7.4的HA过饱和溶液4 ℃低温浸泡24 h和37 ℃恒温浸泡5 d能在多孔钛板表面制备HA钙磷涂层.前处理后的多孔钛在模拟体液中能诱导羟基磷灰石钙磷涂层的生成，表现出良好的生物活性，且经沉积液浸泡后的多孔钛的生物活性更高.

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【责任编辑：陈佳】

Preparationandresearchofbioactiveactivityofhydroxyapatitecalciumphosphatecoatingonporoustitaniumsurface

YANG Li-jun, SHI Lan, YAN Cheng-cheng, ZHANG Jia,WANG Zhe, DAI Wen-hao, LI Ning-ning

(College of Mechanical and Electrical Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021，China)

2017-06-20

国家自然科学基金项目(50972086)

杨立军(1974-)，男，陕西西安人，教授，博士，研究方向：生物医用材料

2096-398X(2017)05-0071-06

TG14

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